25OHDlt;,3gt;-1α羟化酶(CYP27B1)突变基因的功能探究.pdfVIP

中文摘要 250HD3-1 Q羟化酶(CYP2781)突变基因的功能研究 目的： rickets，PDDR)，是一种罕 假性维生素D缺乏性佝偻病(pseudo．vitaminD．deficiency 见的常染色体隐性遗传疾病，系编码250HD3lQ羟化酶的CYP2781基因突变所致， 目前基凶突变已发现近四十种，本组前期的研究首次在5名中国PDDR患者中发现 了4个新突变，但这几个突变对250HD3lQ羟化酶的功能影响尚未证实。因此本实 验的主要目的是在构建CYP27BI体外过表达体系的基础上，研究我组新发现的2 个错义突变G57V和L333F对250HD3lQ羟化酶活性的影响，进而加深临床医生对于 突变型和临床表型关系的认识。 方法： 野生型和突变型基因的质粒DNA。 2．通过阳离子脂质体法转染载有野生型和突变型基因的质粒至293T人胚肾细胞， 构建CYP2781野生型和突变型基因的体外过表达体系 3．转染36小时后，向细胞培养液中加入不同浓度的底物250HD3，然后放入C02培 养箱继续培养，使野生型和突变型酶在适当条件-卜．进行体外羟化反应： 4．收集细胞培养液，经过提取和C18柱纯化，用放免法对不同类型的细胞培养液 与野生型不同基因型之间是否存在显著差异 5．收集完细胞培养液后将细胞提取总蛋白，通过westemblot检测验证野生型和突 变型的蛋白在体外是否有表达及表达水平是否一致。 结果： 1．CYP27BI野生型和突变型基因在293T细胞体外过表达体系中均有所表达，而 且表达水平一致。 L333F的酶活性分别为野生型的56．8％和70．75％。 3 结论：本实验成功构建了l 模型，并以此为基础，对于在中国人群中首次发现的导致PDDR的两个错义突变进 行了功能研究。结果显示：突变型G57V和L333F的酶活性较野生型显著减低，且 与患者的临床表型具有一定联系。 关键词：lQ羟化酶(CYP2781)；细胞转染：293T细胞：放射免疫测定法； 4 ABSTRACT ，n1 ，’ 一 ● ， ● ● _ - _ lne士UnctlOnOt mutatlon1n1Q gene hydroxylase Objective：Pseudo—Vitamin arareautosomai D-DeficiencyRickets(PDDR)，iS recessivedisordercharacterizedthe onsetofricketswithasevere of by early syndrome thecauscofthediseaseismutationinthe la· rickets，and 25-hydroxyvitaminD3 40mutationsinthe hydroxylase(1a—hydroxylase，CYP27B1)gene．Todate，nearly l ofPDDR havebeenidentified．Wedid 4novel a-hydroxylasegene patients identify mutationsin5Chinese beforebutdidnofunction weestablishedan patients study．So culturemodel l the