漆酶活性测定方法.docxVIP

一、 测 O2法 漆酶是一种多酚氧化酶，它所催化的反应过程中有O z 的介入。测量反应的耗 氧 量既可间接地推知漆酶的活性。较早建立的瓦氏呼吸器检测法便是基于这一 原 理。这一方法后来改进为利用氧电极来测量耗氧量，如弗罗纳等以愈创木酚为底物，利用氧电 极测定了漆酶催化反应过程中的耗氧量，并将 1个漆酶活性单位定义为PH6 ． o 及2 5 ℃条件下以愈刨木酚作为电子供体时消耗1. 0 μmo lO2所需要的酶量。亦可取醌醇作底物．利用氧电极测定漆酶的活性。郭明高提出了测定生漆漆酶活性的吸氧法。即将生漆溶于甲苯，测定酶促吸氧速度和累计酶促吸氧量， 同时利用碱促吸氧法测定反应前后漆酚浓度的变化，从而可以求得漆酚浓度衰减的规律 及漆酶促吸氧的克分子比。此法的特点是反应时漆酶处于其天然存l 在的状态而反应底物又恰为漆酶的天然底物漆酚，这在漆酶测活研究中尚属首倒 [ 2 1 。 漆树酶活力检测用0..1mol·L-1磷酸盐缓冲液与有机溶剂配成一定体积的底物，其浓度为1．35×10 mol·L-1。分别移取3mL于1cm测量池和参比池中，恒温水浴中预热 10min．注入20μL漆树酶溶液(含酶2～3 μg)于测量池中，立即搅匀，测定350nm处吸光度A随时间的变化值．漆酶比活力定义为一定温度下,单位酶量催化反应的初速度，单位记为△A350mm(mg·min-1)．将漆树酶在不同溶剂体系中的比活力与漆树酶在纯水体系中的比活力相比，其比值称活力比()212 　漆酶活性的定量测定方法21211 　分光光度计法测定漆酶活性对苯二胺(λmax495) 、愈创木酚(λmax 485) 、邻苯二酚(λmax 400)和漆酚(λmax 420)都可用做漆酶活力测定的底物。不同来源(植物、细菌、昆虫、真菌)的漆酶与底物反应的亲和力不同 ,酶活性测定方法中所用的反应底物、反应条件以及酶活性单位定义对漆酶活性的测定结果有很大的影响。肖亚中等分别以 2 ,2′ 2连氮二(32乙基苯并噻唑262磺酸 ,简称ABTS) 、丁香醛连氮愈创木酚和邻联甲苯胺为底物 ,采用分光光度法测定蜜环菌( Armillaria mellea)胞外漆酶的活力 ,比较了这种底物对漆酶的敏感性 ,结果表明对于同一底物 ,反应时间、温度、缓冲液种类及其 pH值和酶的用量等条件对漆酶催化反应都有不同程度的影响。邻联甲苯胺水溶性较差;愈创木酚为底物时反应非常稳定 ,但反应时间长、测得的漆酶活性值偏低 ,已较少采用;以丁香醛连氮为底物时 ,漆酶活性值虽然较高 ,但当底物和酶液用量较大时反应不稳定 ,若采取减少底物和酶液用量的方法 ,可较大程度地克服反应不易终止的缺陷。目前常以 ABTS 为底物 ,测定漆酶活性 ,反应稳定、重现性好。21212 　通过检测酶与底物中间体来测定漆酶活性在酶反应开始时产物生成量很少,而酶2底物中间体生成的速率较快。若采用初始速率法测定中间体的浓度 ,可间接测定漆酶活性 ,大大提高方法灵敏度。用微量热法测定漆酶的活性 ,样品用量少 ,并且对酶的悬浮液体也能测定 ,适宜研究酶促反应.黄应平等利用反相胶束介质中漆酶氧化邻苯二胺(OPDA反应中间体动态吸收光谱来测定漆酶活性。该方法由于在反相胶束介质中采用初始速率法进行测定 ,具有较高的灵敏度和选择性。已报道的定量测定漆酶活性的方法还有 HPLC法、测氧法等。测氧法灵敏度低,操作繁琐;HPLC法灵敏度高,但仪器昂贵;酶催化光谱分析法应用较普遍,但一般是在水相中测定产物光谱信号变化,灵敏度较低。2　漆酶的酶活测定方法　　测定漆酶活性的方法有HPLC 法、测压法、分光光度法、级谱法等。目前常以3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(ABTS)为底物, 测定酶对其的氧化速度。 具体方法为: 反应在 25 ℃下进行, 在总反应体积 3 mL 中, 含有 2 mL 溶有 0.5 mmo lABTS 的 0.1 mmo lL 醋酸缓冲液(pH = 5. 0) , 添加酶液启动反应, 在 420 nm 下测定其吸光值的变化。酶的活力单位定义为在上述条件下(25 ℃, pH5. 0) 1 mL 酶液每分钟氧化底物(ABTS)引起吸光值的增加量(△OD420/(mL·m in) ).　　Clemm ar J D 等以二茂铁(Fc ·H )作为底物, 在二乙二醇单丁醚(DGBE)磷酸缓冲液中, 用分光光度计在617 nm 处测定漆酶的活性 1 该法无副产物干扰, 重复性好。望天志等采用微量热法测定了漆酶的活性 1。对L KB-2107Batch 型微量热系统, 在温度为298.15 K, pH 为 7.4 的条件下, 测定了漆酶的催化活性。该法的特点是用样品量少, 并且对酶的悬浮液体也能测定, 宜用于研究酶促反应。1.4 分析方法：测定漆酶酶活方法测定漆酶