嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤时机选择的实验探究.pdf

嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤时机选择的实验研究 研究生 张磊 导喜嚣鬟滑郴1煳嬲师 王俊勤 !z型，9到 中文摘要 cord 随着社会的发展，脊髓损伤(Spinalinjury，SCI)已经成为一种发 病率较高的疾病。脊髓损伤常导致严重的伤残，脊髓神经修复与肢体功能恢 复至今仍然是世界医学领域的治疗难题。近年来，在治疗脊髓损伤的移植细 cells，OECs)拥有独特的生物 胞中，由于嗅鞘细胞(Olfactoryensheathing 学特性以及能够促进损伤轴突再生的能力，使嗅鞘细胞成为前景广阔的移植 细胞之一。当前，嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的时机选择仍存在较大争议， 国内外相关研究较少，没有检索到比较有说服力的研究报道。 目的 通过研究嗅鞘细胞移植时机对脊髓损伤神经功能恢复的影响及可能存 在的作用机制，用于指导临床工作中治疗脊髓损伤适宜移植时间的选择，更 好的促进损伤脊髓的修复与再生。 材料与方法 1．嗅鞘细胞的培养、纯化、鉴定、标记与计数 选取2月龄的健康Wistar大鼠，雌雄不限，体重200 2509。将Wistar 大鼠麻醉后，手术开颅、取出两侧嗅球。用改良Nash差速贴壁和阿糖胞苷 (Ara—c)抑制相结合的细胞培养法进行嗅鞘细胞的原代培养、纯化、鉴定， 消化收集计数嗅鞘细胞，并用双苯亚甲胺进行细胞核标记。 2．脊髓损伤动物模型的建立、分组与髓内移植 半切损伤模型。将动物模型随机分为8组：脊髓损伤后立刻移植组(Al组)、 脊髓损伤后I周移植组(Bl组)、脊鬣损伤后4周移植组(Cl组)和脊髓损 伤后8周移植组(Dl组)，同时，每组均设立相应空白对照组(分别为A2 组、B2组、C2组、D2组)。 3。损伤脊髓神经修复的评价 分别选择移植术后1周、2周、4周、6周、8周应用大鼠联合行为学评 分法(改良CBS评分)对大鼠的肢体功能进行评价，观察SCI模型运动功 能情况；移植术后4周、8周制备脊髓标本，首先观察大体形态改变，然后 将标本HE染色和嗜银染色，查看损伤部位脊髓神经轴突的再生情况，最后 行免疫组化染色，荧光显微镜观察标记嗅鞘细胞在脊髓损伤部位的存活以及 分布。 结果 1．应用差速贴壁和Ara—C抑制相结合的纯化培养方法培养出纯度较高的 嗅鞘细胞，可以得到数量为1X108个／ml、纯度达70％以上的细胞，符合实验 所需要求。经培养、纯化7天后细胞密度增大，细胞突起纤细，双极、三极 细胞所占比例较大，胞体呈现梭形、扁圆形和多突起形三种形态，NGFRp75 和GFAP染色反应阳性。 。 2．移植术后大鼠运动功能随时问逐渐恢复。移植4周后CBS评分可见： 组与Bl组之间比较差别无统计学意义(P0．05)，疗效相似，Al组略优于 Bl组；Cl组疗效中等；Dl组最差。空白对照组改善不显著。 CI组均有较多的再生轴突，部分再生神经纤维通过损伤区，Dl组损伤脊髓 处有空洞形成，再生轴突的数量少、散在且无连续性神经纤维通过损伤区。 术后4周时，免疫组化染色和荧光显微镜观察均在损伤部位发现存活的 OECs，其中细胞数量：Al组Bl组C1组D1组。 结论 1．本实验运用差速贴壁和Ara—c抑制相结合的方法纯化培养嗅鞘细胞， 可以得到纯度较高的细胞，且相对实用、经济，具备较好的实验推广价值： 2．嗅鞘细胞移植是治疗脊髓损伤的有效手段； 3．脊髓损伤后立刻与1周后移植疗效最佳，但是二者差别不大；随着损 伤时间的延长，移植疗效逐渐降低。 2 关键词 脊髓损伤；嗅鞘细胞；细胞培养；移植时间；影响 oF ANEXPERIMENTAISTUDYONTHEEFFECT TRANSPLANTINGTIMEONOlFACTORY