VVi和未知蛋白的测定.PPT

* * V。，Vi和未知蛋白的测定 V。大约在9管左右 Vi大约在23管左右 未知蛋白大约在16管左右 五.V。和Vi的测算 层析用凝胶柱在使用前一般都应了解其V。和Vi的大小。对分析用柱尤其是这样。稳定的凝胶拄床，V。通常占柱床总体积Vt的30％左右。V。太大则说明柱床没有达到稳定。对于相同型号凝胶所装的凝胶柱来说，粗颗粒者的V。往往比细粒者为大。 1．V。及Vi的测算 （1） 重量法 已知： Vt＝V0十Vi十Vg＝π/4·d2h Vi=g·Wr 式中g为干胶重量，Wr为“得水率”，即每克干胶之吸液量。 所以 ： V。=Vt－（Vi十Vg） 但这种算法不够准确，主要原因是Vg难以计算，它和凝胶的水化程度有关。一般粗略地将其估算为1cm3／g干胶。 （2） 过柱法 已知物质的洗脱体积 Ve＝Vo十KdVi 如用全渗入（Kd＝1）或全排阻（Kd＝0）的物质过柱，测量其洗脱体积，便可计算出该凝胶柱的V。值及Vi值。实验室中最常用的是蓝色葡聚糖（Kd＝0）及重铬酸钾（Kd＝1），硫酸铵（Kd＝l）等。 2．Kd及Kav的测算 当测得某物质的Ve,并不知道该凝胶柱的柱床总体积Vt，内水体积Vi及外水体积Vo时，根据以下公式不难算出分配系数Kd和Kav值。 Kd与Kav，甚至Ve被认为是一种组分（物质）对于某一个凝胶柱的特征常数。在判断高组分的分离情况，测定分子量以及预测放大柱床后的洗脱体积方面是很有用的。 3．分辨率 凝胶层析中，两物质（A和B）的分辨率（R）定义为： 式中WA、WB分别为两物质洗脱峰的体积。也就是说，分辨率与洗脱体积的差值成正比，而与两物质的洗脱峰宽度成反比（下图）。 洗脱分辨率图 当R值＞1，两物质完全分开。小于l时则不能完全分离。提高分辨率的方法只有增大ΔVe或减小两物质洗脱峰的体积。 因为 VeA＝Vo十KdA·Vi VeB＝Vo十KdB·Vi ΔVe＝Vi（KdB—KdA） ＝ΔKdVi 由于ΔKd是常数，只有增大Vi才能使ΔVe增加。这就是为什么在进行组分分离时要求较大柱床体积的原因。 减少（WA+WB）的方法有浓缩样品（但粘度不能太大）；选用小粒度凝胶、流速适当减慢等。 六.葡聚糖凝胶离子交换剂使用方法 新购进的阳离子交换剂（如CM-Sephadex C-25）为Na型，阴离子凝胶交换剂（如DEAE-Sephadex A-25）为Cl-型，使用前要按一般离子交换剂的使用方法进行转型处理。1g阴离子交换剂约用100mL,0.5mo1/L NaoH溶液浸泡20min后减压过滤，充分洗涤，再用等量0.5mol／L HCL处理，洗至中和备用。阳离子交换剂lg约用100mL 0.5mol／L HCL浸泡20min后过滤，充分洗涤，再用等量0.5mo1／L NaOH溶液处理20min，洗至中性备用。 将以上处理好的葡聚糖凝胶离子交换剂，用20～30倍量与层析时所用的同种缓冲液浸泡（但浓度要高，如0.1～0.5mol／L），再用同种酸或碱调节至所需要pH值，放置1h后，待pH值不变即可减压过滤。 凝胶离子交换剂保存时，需先转成盐型。其他使用方法均同G-类葡聚糖凝胶。再次用缓冲溶液充分浸泡、洗涤，除去气泡后即可上柱。 七、葡聚糖凝胶在生化物质制备中的应用 （—）用G类葡聚糖凝胶浓缩高分子生化物质。 （二）用G－25脱盐 （三）测定分子量 激肽放酶释G-25拄脱盐 分子量的测定方法有两种 （1）求解法 为了求得上述方程中的两个常数K和C,先以两个已知分子量的蛋白质过柱。设其分子量分别为M1、M2，洗脱体积分别为Vl、V2， 解方程组： Ve1=C-KLogM1 Ve2=C- KLogM2 求得C和K以后，将任何一个待测物质的Ve值代入方程便可计算得出其分子量 。 （2）标准曲线法 对于特定的测定系统，先以3个以上（最好更多些）的已知分子的标准蛋白（目前已有配套标准蛋白系列产品出售）过柱，测取各自的Ve值。以Ve作纵坐标，LogM作横坐标制做标准曲线。在同一测定系统中测出未知物质