微生物与遗传工程.ppt

温度诱导 当用λPL、R启动子构建表达载体时，PL、R启动子受λ噬菌体cI基因的负调控，cI基因产生的阻遏蛋白结合在操纵基因上，阻止转录的进行。 目前利用cI的温度敏感突变基因（cI 857 ts）调节这种阻遏。 当在28-30℃培养时，该突变体产生有活性阻遏蛋白，阻遏PL、R转录，细菌大量生长。 在获得足够量菌体后，使温度上升至42℃，造成阻遏蛋白失活，PL、R解除阻遏，启动外源基因的高效转录与表达，从而合成大量有价值的外源蛋白。 转录终止子 转录终止子指一段位于基因或操纵子的３ 末端，具有终止转录功能的特定 DNA 序列。高效表达载体应该含有终止子，因为合成的 mRNA 过长，不仅消耗细胞内的底物与能量，且易使 mRNA 形成妨碍翻译的二级结构。 三 外源基因表达产物 为了在原核细胞中表达非融合蛋白，可将带有起始密码子 ATG 的真核基因插入到合适的原核启动子与 SD 序列下游。 经转录和翻译，就可在原核细胞中，表达出非融合蛋白。 1. 非融合蛋白的表达 2. 融合蛋白的表达 所谓融合蛋白是指蛋白质的 N 端由宿主基因（通常只是 N 端的部分序列）编码， C 端由外源基因编码的蛋白质， 换言之，融合蛋白是由一条短的原核多肽与真核蛋白结合在一起的杂合蛋白。 3. 外源蛋白的分泌表达 分泌型表达载体除具有一般表达载体的基本结构外，还需要具有编码信号肽的序列。 通常信号肽与外源蛋白的 N 端连接，由于信号肽含有带正电荷的氨基酸与疏水氨酸，故能携带表达蛋白越膜分泌到周质或胞外，然后质膜上的信号肽酶将信号肽切除。 4. 包涵体 （ inclusion body ） 当外源蛋白在大肠杆菌高水平表达时，常常在细胞质内聚集而形成包涵体。利用大肠杆菌生产的非融合蛋白多数情况下以包涵体形式存在。 形成包涵体有利于外源蛋白的高水平表达与防止蛋白酶对其的降解，也可避免外源蛋白对宿主细胞的毒害。此外也有利于表达产物的分离。但包涵体形式的表达蛋白不具生物学活性，需要体外复性。 第七节 基因工程的应用 基因工程药物 转基因植物 转基因动物 基因治疗 在微生物研究中应用 基因工程药品 —— 胰岛素 胰岛素是治疗糖尿病的特效药。一般临床上使用的胰岛素主要从猪、牛等家畜的胰腺中提取，每100kg胰腺只能提取4～5g胰岛素。 用该方法生产的胰岛素产量低，价格昂贵，远不能满足社会需要。1979年，科学家将动物体内的胰岛素基因与大肠杆菌DNA分子重组，并在大肠杆菌内实现了表达。 1982年，美国一家基因公司用基因工程方法生产的胰岛素投入市场，售价降低了30%～50%。 干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白。干扰素几乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一种抗病毒的特效药。此外干扰素对治疗某些癌症与白血病也有一定疗效。 传统的干扰素生产方法是从人血液中的白细胞内提取，每300 L血液只能提取出1 mg干扰素。1980～1982年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，是传统的生产量的12万倍。1987年上述干扰素大量投放市场。 基因工程药品 —— 干扰素 基因工程药品 —— 生长激素 治疗侏儒症的唯一方法，是向人体注射生长激素。而生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。 现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。 基因工程药物的生产过程 1、目的基因的提取：分离或合成外源基因。 2、体外重组：外源基因与载体体外连接，构建重组DNA分子； 3、转化：重组DNA分子导入细胞。 4、筛选与鉴定； 5、基因表达：控制适当条件，外源DNA表达。 6、表达产物的纯化 转基因动物 转基因动物指把人或哺乳动物的某种基因导入到哺乳动物(如鼠、兔、羊与猪)的受精卵里，目的基因若与受精卵染色体DNA整合，细胞分裂时，该基因随染色体的倍增而倍增，使每个细胞中都带有目的基因，使性状得以表达，并稳定地遗传给后代，从而获得基因产品。这样一种新的个体，称为~。 转基因植物 1983年世界首例转基因植物培育成功，标志着人类用转基因技术改良农作物的开始。 1986年转基因农作物获得批准进入田间试验; 1994年美国Calgene公司培育的延熟保鲜的转基因番茄被批准商品化生产，2000年全世界转基因农作物的种植面积达4,420万公顷，发展速度非常迅猛。 小结 1. 基因工程，即DNA重组技术，是在分子生物学、微生物学基础上结合有关现代科学与工程学原理和方法而开拓的新兴技术领域。它的出现促使生物技术迅猛发展，改变了生物科学面貌，并带动了生物技术产业的兴起。 2. 基因工程的操作主要包括