活化小胶质细胞对血视网膜屏障影响.pdf

复 旦大 学 附属 眼耳 鼻 喉科 医 院硕 十 论 文 中文摘要 目的 : 1 探 讨 高 效 的大 鼠视 网膜 小胶 质 细 胞 培 养 分 离 纯 化 的方 法 ， 并 观 察 脂 多糖 (liPo po ly sac Cha r ide ，LPS) 激 活 的小胶 质 细 胞 形 态和 功 能变 化 。 2 研 究活化 的小胶 质 细 胞对 人 脐 静 脉 内皮 细 胞 紧 密 连 接 蛋 白 20一1 和 血 管 内 皮 生长 因子 (va seu lar endothelia l gr ow th faetor ，VEGF ) 表 达 的影 响 。 3 观 察活化 的小胶 质 细 胞 玻璃 体 腔 注 射 对 大 鼠血视 网膜 屏 障 (b loo d一ret ina l barr ier ，BRB ) 的影 响 。 方 法 : 1 原代培养 大 鼠视 网膜胶质细胞 ，用振摇法 分 离纯化 小胶质 细胞 并鉴定 ; 用 不 同浓度 的 LPS 激 活 小胶质 细胞 24 h ，观 察 不 同浓度 的 LPS 对 小胶质 细胞 增 殖 的影 响 ，并 检 测 小胶 质 细 胞 释 放 肿 瘤 坏 死 因子 一a (tumo r ne cr o siS faCtor一a lpha ，TNF一a ) 的变 化 。 2 视 网膜 小胶 质 细 胞 纯 化 后 分 为 3 组 : A ，空 白对 照 组 ; B ，未 激 活 的小胶 质 细 胞 组 ; C ， 100 ng/m L LPS 激 活 的小胶 质 细 胞 组 ; 然 后采 用 Tran sw el l 小 室 与人 脐 静 脉 内皮 细 胞 (h 、lfnan um b iliea l ve in endo thelia l eells ，HUVEC s ) 共 培养 24 h 。用 细 胞 免疫 荧光 染色 观 察 各 组 HU VEC S 紧密 连 接 蛋 白 20一1 的 表达 ，并用 W es tern B lot 方法检 测 各 组 细 胞 VEG F 和 20一1 的表达 。 3 将 大 鼠随机 分 为 A 组 、B 组和 C 组 。A 组 ，玻璃 体 腔注射 不含 小胶 质 细 胞 的磷 酸 盐 缓 冲 溶 液 (phosphate buffered So lu t i。n ，PBS ) ; B 组 ，玻 璃 体 腔 注射 含 有 未激 活 小胶 质 细胞 的 PBS ; C 组 ，玻璃 体 腔注射 含 有 100 ng/m L LPS 激 活 的小胶 质 细胞 的 PBS 。7 d 后用 we stern B工Ot 方法 检测 小胶 质 细 胞玻璃体腔注 射 后各 组大 鼠视 网膜 20一 和 VEGF 的表达 ，并观 察伊文 思兰 (eVanS b lu e ，EB ) 渗透 量 的变化 。 结果 : 1 分 离纯化 的小胶 质 细 胞折 光性 强 ，纯度97 .6% ; LPS 活化 的小胶质 细胞 形 态 发 生 改变 ，特 异 性 标 记 抗 体 cD llb 表 达 上 调 ;浓 度 100 ng /mL 及 以下 的 LPs 活化 小胶 质 细 胞 24 h 不影 响小胶 质 细胞 数 量 (乃 0.05 ) ，浓 度 为 1000 ng /mL 的 LPS 作 用 24 h 可 使 小胶 质 细胞 数 量 减 少 (只0.05) ; 浓 度 低 于 1 n g/mL 的 LPS 不 能诱 导视 网膜 小胶质 细 胞释 放 TNF一。 (乃 0.05 ) ; 浓度 1 ng/mL 及 以上 的 LPS 均 可诱 导 小胶质 细胞产 生 TNF一a (只O，05 ) ，并呈剂量 递 增 复旦大学 附属 眼耳鼻 喉科 医 院硕 士论文 趋 势 。 体外 实验细胞免疫 荧光染色 结果显示 ，100 ng /mL LPS 活化 的小胶质 细胞 与 HUvEC S 共培养 24 h 后 ，HUvEC S 的 20一l 表达低 于未活化 的小胶质细胞 作 用组和 空 白对照组 。W estern B lot 结果亦 显示 ，三 组细胞 的 20一1 和 VEGF 蛋 白表达 不全相 同，差异 有 统计 学 意义