不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞冷冻复苏成活率及生长情况的影响.doc

不同冷冻保护剂对小鼠胎儿成纤维细胞冷冻复苏成活率及生长情况的影响 肖家贤 11生物工程1班 20112500075 摘要：本实验以通过原代和传代培养小鼠胎儿成纤维细胞而建立的小鼠胎儿成纤维细胞系为材料，采用慢速冷冻、快速融解的冷冻技术，比较二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、甘油（GL）这三种冷冻保护剂分别与血清的不同配置组合以及这三种保护剂之间的不同配置组合对小鼠胎儿成纤维细胞冷冻后成活率及复苏后细胞培养生长情况的影响。实验结果发现：以10％EG，20％FCS作为冷冻保护剂冷冻效果最好，解冻后细胞的成活率高于其他组合类型的冷冻保护剂，且复苏后细胞培养生长情况良好。 关键词：冷冻保护剂 小鼠胎儿成纤维细胞 成活率 成纤维细胞具有较强的分裂增生能力，适应性强且性状稳定，是研究动物克隆最常用的细胞类型。对于ES细胞的分离和克隆而言,成纤维细胞冷冻保存能随时提供饲养层而不受胎儿、睾丸或其它实验材料不足的限制［1］。 本实验以通过原代和传代培养小鼠胎儿成纤维细胞而建立的小鼠胎儿成纤维细胞系为材料，并用DMSO、EG和GL作为冷冻保护液，添加10%-30%的FCS的DMEM为基础冻存液保存成纤维细胞，筛选合适小鼠胎儿成纤维细胞冷冻保存的保护液组分。 1 　材料和方法 材料与仪器 材料：小鼠胎儿成纤维细胞 试剂：DMEM基础液、20％胎牛血清（FBS）、乙二醇、分析纯二甲基砜（DMSO）、甘油、洗涤液（DMEM+5％胎牛血清）、消化液（DMEM+0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA）、培养液(DMEM+10％胎牛血清),0.1%台盼蓝溶液,10%EG和10%GL冷冻剂 器材：超净工作台、CO2培养箱、离心机、废液缸、倒置显微镜、低温冰箱、酒精灯、分析天平、吸管、25ml卡氏培养瓶、无菌60mm培养皿、烧杯（100ml）、眼科剪、眼科镊、不锈钢筛（100μm）、离心管（10ml）、细胞冻存管、血细胞计数板。 1.2 实验方法与步骤 1.2.1 小鼠胎儿成纤维细胞的获取 处死孕鼠（引颈法），剪开腹腔，取出胎儿，去头、尾、内脏，用酶消化的方法，用DMEM+0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化液2-3ml消化3-5min并收集细胞，2500r/min离心5min弃上清液，用DMEM洗涤液清洗细胞1-2次［2］。 1.2.2 细胞的原代和传代培养 组织块培养法和消化法接种，3天后更换培养液；再过三天，进行细胞的传代培养，并于三天后更换培养液；再3天后，冷冻保存操作：取出传代细胞，去除培养液。 1.2.3 冻存 将细胞冻存管用棉花包好放入泡末小盒,放入沙袋固定好后放入-70℃冰箱中，冻存一个星期。 1.2.4 解冻 将冻存取出,立即投入盛有38℃置37℃、5%二 用血细胞计数板计数，镜检四个大方格，记录活细胞数与细胞总数，并计算其戚率，评价冷冻效果。 2. 结果与分析 表1 实验结果一览表 冷冻保护剂 血清浓度 存活率% 平均存活率% 复苏后细胞培养贴壁效果 组别 10％ DMSO 10％FCS 32.87% 35.98% 满 周三1组 33.85% 满 周三2组 53.24% 满 周四1组 23.95% 满 周四2组 20％FCS 43.32% 51.34% 满 周三1组 52.94% 中 周三2组 46.01% 满 周四1组 63.10% 满 周四2组 30％FCS 58.57% 67.64% 满 周三3组 68.13% 满 周三4组 68.31% 中 周四3组 75.56% 满 周四4组 10％GL 10％FCS 41.55% 44.70% 满 周三5组 37.40% 满 周三6组 62.61% 满 周四7组 37.26% 满 周四8组 20％FCS 46.15% 48.88% 中 周三5组 56.22% 满 周三6组 65.41% 中 周四7组 27.73% 中 周四8组 30％FCS 51.45% 46.26% 中 周三3组 23.42% 中 周三4组 23.30% 满 周四9组 86.89% 少 周四10组 10％ EG 10％FCS 78.98% 74.06% 满 周三7组 61.39% 满 周三8组 86.34% 满 周四5组 69.55% 满 周四6组 20％FCS 64.96% 80.06% 中 周三8组 67.19% 满 周三9组 92.66% 满 周四5组 95.44% 满 周四6组 30％FCS 68.40% 63.24% 中 周三7组 46.86%