分子生物学常用实验的指南.docVIP

生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班） 2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备 3 实验二 质粒DNA的转化 4 实验三 质粒DNA的提取 5 实验四 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 7 实验五 PCR基因扩增 9 实验六 DNA重组 10 实验七 蓝白斑筛选实验 11 实验八 DNA酶切技术 13 实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备 实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 实验操作步骤： 从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中，37℃振荡（200r/min）））实验二 质粒DNA的转化 实验目的：掌握质粒DNA的转化技术 实验原理: DNA能够黏附于感受态细胞的表面，经过42℃短时间的热激处理 可以促进DNA的吸收。转化菌在非选择培养基中保温一段时间后，质粒DNA所携带的抗性基因（Ampr）） 实验三 质粒DNA的提取 一、实验目的：掌握碱裂解法提取质粒的技术和方法 二、实验原理??碱裂解法提取质粒利用的是环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。仪器、材料与试剂??(一)仪器??1．恒温培养箱??2．恒温摇床??3．小型高速离心机??4．??(二)材料试剂?带有pEM-T质粒的大肠杆菌??Solution I [50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl（PH8.0）,10mmol/L EDTA(PH8.0)] 2..??Solution II（0.4mol/L NaOH+2%SDS用前等体积汇合） 3.??Solution III (5mol/L乙酸钾60mL,冰乙酸11.5 mL,DH2O28.5mL) 4.??TE缓冲液 (P)[10mmol/L Tris.HCl(PH8.0),1 mmol/L EDTA(PH8.0)] 5. 0.5mo1／L? RTE (含20μg/mLRNA酶A)??四、实验步骤?将3mL含Amp的LB液体培养基加入到试管中，接入含pEM-T质粒的大肠杆菌，37振荡培养过夜 2.将菌液加入1.5mL离心管中，4000r/min,5min,弃上清；重复一次，增加菌的收集量； 3.在离心管中加入100μL溶液I,涡旋混匀，室温放置10min； 4.加入200μL溶液II，轻轻混匀（颠倒5～10次），待逐渐变清亮后，冰浴2min（操作要轻柔，裂解时间不要超过5min）； 5.加入150μL溶液III（冰上预冷的）加盖，轻轻颠倒混匀数次。在冰上静置15min让质粒DNA复性； 6.12000r/min离心10min，将上清移入另一个1.5mL的离心管中； 7.向上清中加入等体积（约450μL）的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（去蛋白质和脂肪），手摇混匀，12000r/min离心5min，将上清移到另一个新的1.5mL离心管中（操作要平稳，不要将下边的有机相带上来）； 8.向上清中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）（去微量酚和脂肪），轻轻颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清移入另一个1.5mL的离心管中（不要将下边的有机相带上来）； 9.向上清中加入2倍体积的无水乙醇（冰冷的），混匀后，室温放置10min。12000r/min离心10min，弃上清； 10.加入1mL冰冷的70%乙醇，吸打悬浮，12000r/min离心2min，再重复一次。将离心管中的乙醇倒净，倒扣在滤纸上吸干，再置超净台上15min，让酒精挥发干净； 11.加20μLR