实验四dna的提取.pptVIP

DNA的提取生物化学与分子生物学教研室徐宏伟 DNA的提取 DNA的限制性内切酶消化 DNA的凝胶电泳 DNA的Southern印迹杂交分析 实验目的 1、掌握真核细胞中DNA制备原理 2、熟悉从外周血白细胞中提取DNA的方法 3、掌握紫外分析仪检测DNA的原理 DNA的提取 获得相当纯度和完整性的基因组DNA，是对真核细胞进行基因分析及基因诊断的前提 较理想的DNA样品 1、不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子 2、最大程度的降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染 3、排除RNA分子的污染与干预 100-200kb左右的基因组DNA片段，可用于 DNA酶切图谱 多态性分析 基因诊断 构建基因组文库 哺乳动物的一切有核细胞都可以用来制备DNA 1、外周血白细胞 2、口腔上皮细胞 3、发根细胞 产前诊断所用的材料为胎儿的羊水细胞或绒毛膜细胞 低温冷冻保存 ，防止内源性酶类对DNA的损害 真核DNA以核蛋白形式存在于细胞核中 核DNA 线粒体DNA 1、将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离 2、保持DNA分子的完整 从外周血白细胞提取DNA (一)分离白细胞 1．从全血中提取细胞核 2．等渗法分离白细胞 3．从淋巴细胞分离液分离白细胞： 4. 低渗溶血法： 从外周血白细胞提取DNA 从静脉血l0～15ml中一般可获得DNA200～300μg 血凝块也可用来提取DNA，用组织匀浆器将血凝块研开后，按一般抗凝血步骤提取。 (一)分离白细胞 1．从全血中提取细胞核： 试剂：2×ST溶液 含0.64mol／L蔗糖、0.02mol/L Tris-HCl pH7.6、0.01mol/L MgCl2、2％Triton X-100 操作程序： 向抗凝血中加入等体积2×ST溶液，剧烈混合，置冰浴中15分钟(溶液变透亮)，1000×g离心10分钟，倒掉上清，并用吸水纸擦去离心管壁上的血红蛋白溶液。用此法时最好不用肝素作抗凝剂。 2．等渗法分离白细胞： 试剂: 等渗溶血液 155mmol/L NH4C1、0.1mmol/L EDTA·2Na、10mmol/L KHCO3，pH7.4 操作程序：向抗凝血中加入2倍体积的等渗溶血液剧烈混合，置冰浴中15分钟(溶液透亮)。1000×g离心10分钟，倒掉上清，用吸水纸擦去管壁血红蛋白溶液。 3．从淋巴细胞分离液分离白细胞： 试剂：淋巴细胞分离液 Ficoll 400(聚蔗糖)溶于PBS，密度为0.077—0.079。 操作程序：用冷PBS等体积稀释抗凝血，在15ml透明离心管中加入4ml淋巴细胞分离液，向分离液上缓慢地加稀释后的血液，1000×g离心20分钟，小心地将淋巴细胞分离液中的白色细胞层吸到另一离心管中，用PBS洗涤细胞并离心沉积细胞。 4. 低渗溶血法： 1体积全血加5倍体积蒸溜水，混匀，0℃放置5分钟，3000r／min离心10分钟，去上清血红蛋白液，用生理盐水洗涤白细胞沉淀，再离心一次，弃上清获得白细胞 （二）蛋白酶消化 蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为广谱蛋白酶 其重要特性是能在SDS和EDTA存在下保持很高的活性 SDS可破坏细胞膜、核膜，使组织蛋白与DNA分子分离 EDTA则抑制细胞中DNase的活性 蛋白酶K或链霉蛋白酶E可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来 (二)蛋白酶消化 1. 加入STE将细胞或组织碎块充分悬浮 2.加入SDS和蛋白酶 (终浓度为100μg~200μg/ml) 加人SDS后细胞破裂释放出DNA液体将变得粘稠 蛋白酶K工作浓度0.05~1mg/ml，温度50~55℃进行，时间可缩短至2-3小时。时间可视消化的彻底程度而定。 消化破裂细胞膜与核膜，蛋白质变性并降解成小肽或氨基酸 保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。 （三）去蛋白 1. 酚抽提法 2. 盐析法 也可单纯依靠酚抽提去除蛋白质 酚能变性蛋白质，并将变性的蛋白质溶解在其中 氯仿也是一种有效的蛋白质变性剂，并能促进两相的分离 用酚、酚/氯仿抽提以除去蛋白质 接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染 最后用无水乙醇沉淀DNA 为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNase, 除去RNA 2. 盐析法 (1)蛋白酶消化完毕后，加入1／3体积的饱和氯化钠溶液，剧烈摇混15秒钟，离心2000r/ min l0分钟，去除蛋白和SDS的沉淀； (2) 将上清吸入另一试管中，用等体积氯仿抽提一次 （四）乙醇沉淀DNA 不得过度干燥DNA，以免溶解困难，以DNA团块透明为度 溶液中DNA浓度较高（0.25m