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自编遗传学实验讲义的
遗传学实验
温州大学《遗传学》课程组编写
2015年2月
实验一 植物染色体压片法
实验原理
植物根尖的分生细胞的有丝分裂,每天都有分裂高峰时间,此时把根尖固定,经过染色和压片,再置放在显微镜下观察,可以看到大量处于有丝分裂各个时期的细胞和染色体。
实验目的
根尖染色体压片法,是观察植物染色体最常规的方法,也是研究染色体组型、、染色体分带、染色体畸变的姊妹染色单体交换的基础。
实验材料
大蒜、洋葱的鳞基或蚕豆的种子。
实验器具和药品
1、用具:染色板,载玻片,盖玻片,指管,温度计,试剂瓶,滴瓶,镊子,解剖针,毛边纸。
2、药品:无水酒精,70%酒精,冰醋酸,对二氯苯或秋水仙素,醋酸钠,碱性品红,石碳酸,甲醛,山梨醇,纤维素酶,果胶酶,中性树胶或油派胶,二甲苯。
卡诺固定液的配制:用3份无水酒精,加入1份冰醋酸(现配现用)。
酶液的配制:以0.1mol/L醋酸钠为溶剂,配成纤维素酶(2%)和果胶酶(0.5%)的混合液。
染色液的配制:配方Ⅰ。石碳酸品红,先配母液A和B。
母液A:称取3克碱性品红,溶解于100毫升的70%酒精中(此液可长期保存)。
母液B:取母液A10毫升,加入90毫升的5%石碳酸水溶液(2周内使用)。
石碳酸品红染色液:取母液B45毫升,加入6毫升冰醋酸和6毫升37%的甲醛。此染色液含有较多的甲醛,在植物原生质体培养过程中,观察核分裂比较适合,后来在此基础上,加以改良的配方∥,称改良石碳酸品红,可以普遍应用于植物染色体的压片技术。
配方∥:改良石碳酸品红
取配方Ⅰ,石碳酸品红染色液2-10毫升,加入90-98毫升45%的醋酸和1.8克山梨醇。此染液初配好时颜色较浅,放置两周后,染色能力显著增强,在室温下不产生沉淀而较稳定。
实验说明
1、根尖由于取材方便,是观察植物染色体最常用的材料,有些植物种子难以发芽,或仅有植株而五种子,也可以用茎尖作为材料。
2、植物细胞分裂周期的长短不尽相同,通常在十到几十小时之间,温度明显地影响分裂周期,对于一个不太熟悉的实验材料,最好在特定温度下长根,掌握有丝分裂高峰期,以便得到更多的有丝分裂细胞。
3、前处理的目的是降低细胞质的粘度,使染色体缩短分散,防止纺锤体形成,让更多的细胞处于分裂中期,一般在分裂高峰前,把根尖放到药剂中处理3-4小时。可处理的药剂很多,如秋水仙素,对二氯苯,8-羟基喹啉等。
4、解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解,细胞壁软化或部分分解,使细胞和染色体溶液分散压平,解离方法有酸解法和酶解法。
(1)酸解法是用盐酸水解根尖,步骤简便、容易掌握,广泛应用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观察。根尖分生组织经过酸解和压片后,都呈单细胞,但是大部分分裂细胞的染色体还包在细胞壁中间。
(2)酶解法常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换等项研究,通过解离和压片,使分生细胞的原生质体,能够从细胞壁里压出,再经过精心的压片,使染色体周围不带要细胞质或仅有小量细胞质,致使多项压片措施直接作用于染色体。
实验步骤
(一)将大蒜或洋葱的鳞基,置于盛水的小烧杯上,放在25℃温箱中,待根长到2厘米左右时,在上午九时摘下根尖,放到对二氯苯饱和水溶液,或0.02%秋水仙素中,浸泡处理3-4小时。
(二)经过前处理的根尖,再放到卡诺固定液中,固定24小时。固定材料可以转入70%酒精中,在4℃冰箱保存,保存时间最好不超过两个月。
这里介绍两个解离方法,可以根据实验需要选择使用。
1、酸解:从固定液中取出大蒜或洋葱根尖,用蒸馏水漂洗,再放到0.1mol/LHCL中,在60℃水浴中解离8-10分钟,用蒸馏水漂洗后,放在染色板上,加上几滴改良石碳酸品红染色液,根尖着色后即可压片观察。
2、酶解:取大蒜或洋葱的固定根尖,放在0.1mol//L醋酸钠中漂洗,用刀片切除根冠以及延长区(根尖较粗的蚕豆,可以把根尖分生组织切片成2-3片),把根尖分生组织放到醋酸钠配制的纤维素酶(2%)和果胶酶(0.5%)的混合液中,在28℃温箱中解离4-5小时,此时组织已被酶液浸透而呈淡褐色,质地柔软而仍可用镊子夹起,用滴管将酶液吸掉,再滴上0.1mol/L醋酸钠,使组织中的酶液渐渐渗出,再换入45%醋酸。
酶解后的根尖,如作分带或姊妹染色单体交换,可用45%醋酸压片,如作核型分析或染色体计数等常规压片,可放在改良石碳酸品红中染色,经过酶的处理的组织染色速度快。
(四)压片:把染色后的根尖放在清洁的载玻片上,用解剖针把根冠及延长区部分截去,加上少量染色液,并盖上盖玻片。一个解离良好的材料,只要用镊子尖轻轻地敲打盖玻片,分生组织细胞就可铺展成薄薄的一层,再用毛边纸把多余的染色液吸干,经显微镜检查后,选择理想的分裂细胞,再在这个细胞附近轻轻敲打,使重叠的染色体渐渐分散,就能得到理想的分裂相,要达到这个目的,必须
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