荧光定量PCR的原理嫉陌应用.pptVIP

;荧光定量PCR仪的应用;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;PCR的反应过程;实时荧光定量PCR ;实时荧光定量PCR中的三个概念;增长曲线 反映荧光强度与循环数的对应关系;域值：PCR扩增信号进入相对稳定对数增长期时的荧光值。;Ct值 Ct值:C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。;Ct值与起始模板的关系 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多， CT值越小；模板DNA的起始拷贝数越少，CT值越大。 一般正常的CT值范围在15-35之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。; 荧光定量PCR标记方法 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen);5’;5’;SYBR Green? I;熔解温度(Tm值);Melt Curve Analysis;R;优点： 对目标序列有很高的特异性，在病原微生物特异性检测上有独特优势 设计简单，准确性好 缺点： 只适合于一种特异目标的检测，相对价格略高;荧光定量PCR实验技术路线;引物设计的一般原则： 产物长度在80-300bp之间 产物GC含量在50-60%之间 引物的GC含量在50-60%之间，熔解温度在55-65℃之间 应避免引物中有连续的G或C，但推荐在引物的末端含有G或C Primer 5.0 /Scitools/Applications/PrimerQuest/Default.aspx?SequenceWarning=True ;荧光定量PCR实验技术路线;荧光定量PCR实验技术路线;荧光定量PCR实验技术路线;定量方法;;绝对定量;相对定量——在一定样本中靶基因相对于另一参照样本的量的变化 ;比较CT法（ △△CT ） 前提：每个循环增加一倍的产物数量，靶基因和看家基因的扩增效率基本一致 双标准曲线法 利用两组标准曲线分别得到目的基因及持家基因的表达量 样本目的基因表达量= ;目标基因与持家基因扩增效率差别举例 ;相对定量方法二——双标准曲线法;谢 谢 !