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分子生物学之应用与发展 授 课 教 师：李 元 凤 一 、重组DNA (Recombinant DNA)的步骤 选择载体(cloning vector) 以适当的限制脢(restriction endonuclease)切分载体 将欲选殖或增幅之外来DNA与载体接合(ligation)，DNA (hybrid DNA) 将杂合DNA送入宿主(host)细胞中，此谓转型(transformation) 筛选及鉴定正确之杂合DNA (载体的来源 细菌: 细菌体内含有会自行复制之小分子核酸个体 噬菌体(bacteriophage) 酵母菌(yeast): 酵母菌体内含有会自行复制之核酸个体 (重组DNA的来源 化学合成 大分子DNA以限制脢切成小分子DNA mRNA反转录(reverse transcription)合成cDNA (转型 利用细菌转型法将杂合DNA送回细菌体内 利用酵母菌转型法将杂合DNA送回酵母菌体内 二、 分离与选殖单一基因 重组DNA技术可以增幅，DNA序列及其功能。(genomic library)， 筛选的方法有数种，最常用的方法之一为南方点墨杂交法(Southern hybridization) (重组DNA技术的应用 重组蛋白质(recombinant protein)之生产 基因改造之物种(农作物或微生物) 基因治疗(gene therapy) 三、 以聚合脢连锁反应(polymerase chain reaction, PCR)来增幅DNA 如果DNA序列已知的话，则可用PCR来大量增幅此DNA片段 PCR反应需要三种主要成分: 人工合成的DNA引子(primers)，DNA聚合脢(polymerase)及去氧核糖核甘酸(dATP, dTTP, dCTP, dGTP) PCR以下列三个步骤做循环反应: 变性(denaturation)， 黏合(annealing)及DNA合成(polymerization)反应 四、 PCR的应用 医学诊断(medical diagnostics): 传染性病源，遗传疾病，癌症 法医学(Forensics): DNA fingerprint 五 、微点阵(Microarray)及生物晶片(Biochip) 将探针(通常是DNA或cDNA)以高密度点阵排列在一小片基质上，即所谓”晶片”。DNA/cDNA晶片就能够将成千上万的基因序列或表现型式记录下来。 六、 以分子遗传学筛检海洋性贫血(Thalassemia) 海洋性贫血是一种先天遗传性的血液疾病，人体之正常红血球含有A， A2F三种血红素，这些血红素皆由四条血红蛋白链组成，分为????(HbA),?2(2(HbA2), ?2(2(HbF)。如基因突变则造成某种血红蛋白链合成不足，而其他蛋白链合成过剩，导致造血不足或易溶血之现象，即为贫血。血红蛋白链基因分析的检体可来自血液，羊水或胎盘之绒毛。DNA分析有下列两种方法: 南方点墨杂交法(Southern hybridization) 利用血红蛋白链的基因做探针(probe)与待测DNA杂交，经由电泳分离后，以其特殊之型式诊断是否有基因突变。 聚合脢连锁反应(polymerase chain reaction, PCR) 以PCR方法大量复制检体内血红蛋白链的基因，利用限制脢片段长度多型性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)或直接作DNA序列分析(sequencing analysis)，检查是否有基因突变。 七、 以分子遗传学检定乳癌/卵巢癌之BRCA1 BRCA2基因变异 大部分的遗传性卵巢癌是由基因BRCA1的变异所引起。近几年之族群研究显 示，20%至30%带有BRCA1基因变异的女性，在四十岁之后将有得到卵巢癌的可能性。带有BRCA2基因变异的人则较可能发生早期性乳癌，目前显示近35%的遗传性卵巢癌患者也带有BRCA2基因的变异。BRCA1基因片段先经由聚合脢连锁反应增幅后，以下列三种方法分析其变异 (mutation): 单股DNA结构多型性(SSCP)分析: 不同的DNA序列，电泳分离后之位置不同，此法可分析DNA是否有变异。 DNA(sequencing analysis): 可鉴定DNA之变异位置及种类。DNA 晶片(DNA chip)分析: 可同时分析整个BRCA1基因。 ( 参考资料: Becker WM, Kleinsmith LJ, and Hardin J. World of the Cell. The Benjamin / Cumming Publishing Company. 2000 Brown TA. Genome. BIOS Scientific Publishers,