湖南农业大学基因工程重点更具老师整理.docVIP

1909年，丹麦生物学家，创造了基因(gene)一词 1944年，美国著名微生物学家O.T. Avery证明了基因的物质基础是DNA 1953年，J. Watson和F. Crick的DNA双螺旋结构模型, 揭示了DNA的分子结构. 特别是DNA半保留复制规律。 DNA的半保留复制 复制子：由复制起点开始合成的一段DNA序列。 复制起点：在大肠杆菌中其复制起点由245个碱基对组成，由两段保守的重复序列组成。 1958年，F. Crick提出了描述DNA、RNA和蛋白质三者关系的所谓中心法则(central dogma) 5.基因的表达与调控（操纵子学说）基因依其功能差别可以分成调节基因、操纵基因和结构基因三大类。 一、基因工程的概念 是指按照人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），在体外切割、拼接形成重组DNA，然后将重组DNA与载体的遗传物质重新组合，再将其引入到没有该DNA的受体细胞，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出新性状，并能稳定地遗传给下一代。 供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。 技术上的三大发明：DNA分子的体外切割与连接技术、基因工程载体的使用、DNA分子的核苷酸序列分析技术、琼脂糖凝胶电泳和Southern转移杂交等技术 基因工程的主要研究内容或步骤 分、从复杂的生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。 切、在体外，用限制性内切核酸酶切割目的基因和基因载体，以利于将两者连接形成重组体 接、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 转、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞），并与之一起增殖 筛、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆 表。 外源基因的高效表达的措施： 1、提高外源基因的剂量 2、筛选、修饰充足基因表达的转录调控元件：启动子，增强子，上游调控序列，操作子，终止子 3、修饰和构建蛋白质生物合成的翻译调控元：选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控原件，强化受体细胞中蛋白的生物合成过程。这些涉及到基因表达调控的分子生物学原理。 4、工程菌的稳定生产与增殖：合理控制微型生物反应器的增值速度和最终数量。 第二章 基因操作基本技术 第一节 凝胶电泳技术 电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。 电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 一、电泳的基本原理 在溶液中任何一个带电颗粒在电场作用下的移动大致要受到三方面的影响： ①颗粒的性质，如：实际电荷，大小及形状，解离强度的难易等。 ②所处的环境，如：电解质或缓冲液的浓度，离子强度，pH，粘度，温度等。 ③应用电场的性质，如：电场强度 不同带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同，常用泳动度或迁移率来表示，迁移率是指带电颗粒电场强度下泳动的速度。 三、电泳的分类 按有无固体支持物区分又可以分为: 自由电泳和支持物电泳两大类 四、凝胶电泳 （1）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由D—半乳糖和3、6—脱水—L—半乳糖结合的链状多糖 。 ⒈ 琼脂糖凝胶电泳的原理概述 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。 2、DNA分子的迁移速率由下列多种因素决定: 1） DNA的分子大小: 　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量成反比。 ?分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中泳动，因而迁移得越慢。分子越小，所受阻力越小，迁移得越快。 2）凝胶浓度　　凝胶浓度直接影响凝胶的孔径。浓度越高，孔径越小，其分辨力越强。DNA分子电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。 3） DNA分子的构型 　　相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的, 共价闭合环环状DNA（cccDNA）直线DNA（ L DNA ）开环的双链环状DNA(ocDNA)。 4） 电源电压 　　一般电压不得超过5v/cm。 5） 离子强度影响 　　在没有离