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第十二章?? 可见紫外分光光度法 (Spectrophotometry) 主要内容 第一节 物质的吸收光谱 第二节 分光光度法基本原理 第三节 可见分光光度法 第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法 第五节 紫外分光光度法简介 目的要求 掌握分光光度法的基本原理——Lambert-Beer定律；吸光度及透光率、吸光系数、摩尔吸光系等概念、相互关系及计算。 熟悉标准曲线法及标准对照法。 了解吸收光谱的意义及绘制方法。 了解分光光度计的基本构造,提高测量灵敏度和准确度的方法。 了解可见分光光度法和紫外分光光度法的异同点。 分光光度法 根据物质的吸收光谱及光的 吸收定律，对物质进行定性、λυ定量分析的一种方法。 预习问题与提纲 1．在吸收光谱中，定性分析和定量分析 的依据是什么？ 2． Lambert–Beer定律的公式及应用？ 3．可见分光光度法有哪两种？ 4．分光光度法的误差有哪些？ 5．如何提高分析的准确度？ 主要内容 第一节 物质的吸收光谱* 第二节 分光光度法基本原理* 第三节 可见分光光度法* 第四节 提高测量灵敏度和准确度的方法* 第五节 紫外分光光度法简介* 本章小结* 参考文献* 第一节 物质的吸收光谱 一、物质对光的选择 性吸收 物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。 第一节 物质的吸收光谱 二．物质的吸收光谱 （A -λ图） 以波长?为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，可得一曲线，即为吸收光谱(absorption spectrum)或称吸收曲线(absorption curve),右图为不同浓度时三(邻二氮菲)合铁(II)配离子的吸收光谱。 第一节 物质的吸收光谱 特点: ① 具有最大吸收波长。 ②不同物质, λmax不同，λmax 是定性分析的依据。 ③λmax几乎不随物质的浓度而变。 第一节 物质的吸收光谱 ④λmax附近，A最大，并与浓度c 呈正比关系 ---- 定量分析依据。 ⑤远离λmax的光,物质几乎不吸收光（A→0）,这些光的A与物质的c无直接关系----不作定量分析依据。 注意：物质对光的吸收越多，呈颜色 　　　越深， 溶液浓度越浓。 第二节????分光光度法?基本原理 一、透光率和吸光度 入射光 I0 ? 吸收Ia ?透射It I0= Ia+ It 透光率 T = It/ I0 第二节????分光光度法?基本原理 I0?溶剂 ?I0, I0?溶液? It ∴ T = It / I0 透光率的负对数称为吸光度， 用符号A表示。 A愈大，溶液对光的吸收愈多。 吸光度 A = -lgT =lg I0/ It 第二节????分光光度法?基本原理 二? Lambert―Beer 定律 当I0一定时，A只与液层厚度（b）和 溶液浓度C有关： ① Io，c一定，A∝b ② Io，b一定, A∝c ∴ A = abc 注意： Beer定律仅适用于单色光。 第一节???? 物质的吸收光谱 单位： 　b ---- cm。 　a为吸光系数：L g-1 cm-1 , c单位:g/L。 ε为摩尔吸光系数：L·mol-1·cm-1，c单位：mol/L， a与ε的关系:ε= aM 　M表示被测物质的摩尔质量。 第二节????分光光度法?基本原理 由Lambert―beer定律 可知吸光度与溶液浓度之间为正比关系，而透光率与溶液浓度之间为指数函数 关系： -lgT = ?bc T =10-?bc 第二节????分光光度法基本原理 例：已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇配成浓度为0.150mmol?L-1的溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得透光率为39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数?及质量吸光系数a。 解： 第二节????分光光度法基本原理 例：测试酶与腺苷酸(AMP)体系的吸光度如下 A(280nm) = 0.46， A(260nm) = 0.58， 试计算 每一组分的浓度。