提高重组酵母质粒稳定性和蛋白质产率的培养策略的分析研究.pdfVIP

摘 要 本文以产Q一淀粉酶的基因工程酵母菌S．cerevisiae 20B一12(pNA3) 为模型体系，在摇瓶培养条件下对外源基因的表达和发酵进行了初步研究， 并在2L发酵罐中对发酵工程条件影响质粒稳定性进行了深入的研究，然 后对重组酵母发酵动力学进行了数学模拟。 f通过继代摇瓶实验发现，在选择性压力下，重组酵母的质粒稳定性在 整木培养过程中保持90％以上。当解除选择性压力后，重组酵母的质粒很 快出现缺失，但刚开始比率很低，随后质粒的缺失速度加快。重组酵母培 养130小时后，质粒几乎100％的缺失。同时我们比较了平板点种法和平 板稀释法测定质粒稳定性的方法，两者结果基本一致。 在摇瓶培养中通过均匀实验对培养条件优化，得出在摇瓶中的较佳培 养条件：葡萄糖的浓度是34．89／L，酵母基础氮的浓度是6．69／L，初始pH 是5．8，诱导产酶酵母膏加入时间是当葡萄糖浓度小于O．2999／L。 接着在2L发酵罐中分别考察在诱导阶段温度、溶氧和pH变化对重组 酵母S．cerevisiae 中对发酵条件影响质粒稳定性进行了深入的研究，在对表达外源n．淀粉酶 的重组酿酒酵母菌株S．cerevisiae 生长静止期质粒稳定性提高的规律。将此应用于诱导分泌表达外源蛋白质 的无选择性压力培养阶段。证明脉冲添加酵母膏对稳定质粒同时诱导SUC2 启动子控制的外源基因表达是有效的。 结合菌体增殖、质粒稳定及诱导表达的需要，提出了恒流量流加营养 物，同时脉冲补加酵母膏的营养物脉冲高密度培养方案，实现了外源蛋白 质的效率化生产，最大菌体密度、最大a-淀粉酶活力分别达到36．4 g／L和 207．6 U／mL，培养过程质粒保持率稳定于90％以上。 最后在上述研究的基础上初步建立了重组酵母发酵的动力学模型，并 对模型参数进行估计。 由于糖分解酶启动子、营养缺陷型选择性压力在重组酿酒酵母菌株构 建中广泛采用，本文提出的培养方案对该类基因工程菌株高密度培养生产 外源蛋白质有借鉴意义。 ／ ， j／ 关键词基因工渔质粒稳≤性重组酷每 流力藩略 外源富，白生产 a一淀粉酶 ABSTRACT recombinant 20B-1 Inthis the yeast，S．cerevisiae2，carryingplasmid study for of wasusedasmodel todemonstrate a—amylase system pNA3production theeffectsoffermentationonenhanced and strategy plasmidstability also modelwas mathematical simple heterologousproteinproduction．A kinetics thefermentation tosimulate developed