PGA固定化及其基因的真核表达的分析研究.pdfVIP

摘要 摘要 G 3．5．1．11，简称PGA)可以催化青霉素G 青霉素G酰化酶(penicillinacylase，EC 此，PGA具有重要的工业价值。 本文根据GenBank中已有的巨大芽孢杆菌PGA基因序列设计了上下游引物，通过 PCR扩增出巨大芽孢杆菌(Bacillus pYES2．PGA，并转化进酿酒酵母(Saccharomyces 菌株Y1、3(2、Y3、Y4。在不需要苯乙酸诱导的发酵培养中，均在培养液中测到了青霉 素酰化酶活性，其中Y4的酶活最高，达到0．75U／ml。如果再进行发酵培养等优化，还 三株巨大芽孢杆菌的PGA基因序列比对，表现出很高的同源性，分别达到97．1％、 99．8％和99．8％。 固定青霉素酰化酶在工业生产半合成抗生素中具有重要作用，本实验还采用包埋法 将无机磁性粒子Fe30。与有机材料海藻酸钠结合起来形成的一种复合磁性微胶囊，表面 含有特征性功能基团。从而有效提高固定化青霉素酰化酶的稳定性和回收率。通过对青 霉紊酰化酶的固定化研究，优化了固定化参数：给酶量为333．3 U／g(于载体)，反应时 『目J为4 u倌(干载体)， h，pH为7．5，反应温度37℃。在此条件下固定化酶活性为173．6 40℃，且固定化酶的储存和多次实验操作稳定性良好。除此之外，测定了酶促反应的动 m01／I和0．421mo川。 力学常数：溶液酶和固定化酶的米氏常数分别为0．245 关键词青霉素酰化酶：酿酒酵母：基因表达；固定化 Abstract G the of Ginto6- Penicillin acylase(PGA)catalyzeshydrolysispenicillin 6-APAisthe intermediateinthe of aminopenicillanicacid(6一APA)．As key production isof industrialinterest． semisyntheticpeniciUins，whichgreat were based A of onthe PGA ofBacillus pairprimersdesigned publishedgenesequence in the fromBacillus 1．1741was inthis GenBanL megaterium PGAgene megaterium amplified the T71ac PGAinto vectorcontrolled and study．Clonedgene pYES2(amp+uralby promoter in cerevisiae recombinantsof expressedSaccharomycesH158(his。trp‘leu‘ura)．4Y1，Y2,Y3， Y4wereobtained．thePGA wasdetectedint