scp实验操作.ppt

* PCR-单链构象多态性 (PCR-single-strand conformation polymorphism，SSCP) 单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由 其内部碱基配对、氢键等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或 少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常 敏锐地将构象上有差异的分子分离开。该方法即为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析。 基本原理 将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，建立PCR-SSCP技术。 基本过程： ①PCR扩增靶DNA; ②将特异的PCR扩增 产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子； ③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳; ④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。 若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。 PCR-SSCP基本过程 SSCP的应用 进行人类DNA多态性分析，大量地用于检测和肿瘤发生 有关的基因突变。 如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的 p53基因的突变、肺癌的ras基因突变等。 用于检 测引起人类遗传性疾病的研究上 。 如在囊性纤维化中起作用的CFTR基因、神经纤维瘤 1型基因、家族性结肠息肉基因的研究中。 用于病毒的分型、监测PCR实验中的污染 情况、以及病原体传播途径的研究中。 Yap用巢式PCR对来自不同国家和地区的HBV标品 进行了检测，并对扩增产物进行了SSCP分析，发现每个标本的SSCP图谱完全不同 ，不仅证明了HBVDNA具有地区性变异，而且排除了交叉性污染的可能性。 PCR-SSCP的实验操作 1.在进行SSCP前首先要通过PCR扩增出特异性好的产物(琼脂糖电泳不能有过强的拖尾和引物二聚体)。 2.制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)  （1）电泳槽玻璃板的处理：用洗涤剂清洗玻璃板，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗，95％乙醇擦拭，通风橱自然晾干。两块玻璃对齐，底部和两侧用橡胶条封好，用1%琼脂糖胶封底，固定在垂直电泳槽上。 （2） 制胶：按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积，一般来讲使用5％～8％的凝胶较为合适。 PCR-SSCP的实验操作 在小于1Kb长度的情况下，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下: DNA片段长度(核苷酸数) 丙烯酰胺(%) 1Kb～700b 3.5 700b～500b 5 500b～200b 8 200b 10-12 PCR-SSCP的实验操作 PAGE的制备： 成分： 浓度：8% 10% 40%丙烯酰胺 8ml 10ml ddH2O 26ml 24ml 甘油 4ml 4ml 10 ×TBE 2ml 2ml TEMED 40ul 40ul 10%AP