实验六DNA指纹图谱分析.PDFVIP

实验六 DNA指纹图谱分析 （综合性开放性实验） 一、 实验目的 1. 掌握DNA指纹图谱技术的概念、原理和基 本操作过程 2. 学习DNA的限制性酶切的基本技术 3. 掌握琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术，学 习利用琼脂糖凝胶电泳测定DNA片段的长 度，并能对实验结果进行分析。 二、实验原理 • DNA指纹图谱是采用检测DNA多态性 （生物 的不同个体或不同种群在DNA结构上存在 差异）的多种多样的手段，如RFLP （限制 性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串 联重复序列分析、RAPD （随机扩增多态性 DNA）分析等，产生的具有完全个体特异的 DNA多态性图谱。 • DNA指纹具有下述特点： • 1．高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同 DNA图形的概率仅3 ×10-11；如果同时用两种探针进行 比较，两个个体完全相同的概率小于5×10-19。全世界人 口约50亿，即5×109。因此，除非是同卵双生子女，否 则几乎不可能有两个人的DNA指纹的图形完全相同。 • 2．稳定的遗传性：DNA是人的遗传物质，其特征是由父 母遗传的。分析发现，DNA指纹图谱中几乎每一条带纹 都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟 德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50%给子代。 • 3．体细胞稳定性：即同一个人的不同组织如血液、肌肉、 毛发、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。 • DNA指纹图谱法的基本操作： • 从生物样品中提取DNA （DNA一般都有部分的降 解），可运用PCR技术扩增出高可变位点 （如 VNTR系统，串联重复的小卫星DNA等）或者完 整的基因组DNA，然后将扩增出的DNA酶切成 DNA片断，经琼脂糖凝胶电泳，按分子量大小分 离后，转移至尼龙滤膜上，然后将已标记的小卫 星DNA探针与膜上具有互补碱基序列的DNA片段 杂交，用放射自显影便可获得DNA指纹图谱。 三、 实验材料 • 1. DNA样品来源： • 枯草芽孢杆菌、 • 苏云金芽孢杆菌、 • 两种鸡 （三栋鸡与白毛乌骨鸡）的血液 四、 实验器具和药品 1.实验试剂 （1）DNA样品反应缓冲液：100mM Tris，200mM NaCl， 20mM MgCl2，2mM DTT，pH 8.0 2X CTAB提取缓冲液：2%(W/v) CTAB,100mM Tris- HCl(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.4M NaCl,1%(W/v)PVP-400,40mM ß-巯基乙醇。 （2）EcoR Ⅰ限制性内切酶 （3） EcoR V 限制性内切酶 （4）电泳缓冲液 （50 ×TAE） Tris 242g 冰醋酸 57.1ml EDTA （0.5mol/L pH 8.0） 100ml 使用时用蒸馏水稀释50倍。 （5）样品缓冲液 （DNA sample loading dye） 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青 40% （W/V ）蔗糖 （6）Gold View 10mg/ml （7）琼脂糖agarose （电泳级） （8）DNA分子量标记物：Lambda HindⅢ DNA markers 2. 仪器设备和消耗品 电泳仪、电泳槽、样品梳、微波炉、水浴锅、 移液器 （10 μl，200 μl，1000 μl）、离心 管、一次性枪头 （200 μl，1000 μl）。 五 、实验过程 1.DNA样品的制备 （1）细菌DNA提取 （2 ）血液DNA提取 按照试剂盒说明书操作 2. PCR扩增目的片段 （1）基于目的片段设计PCR扩增引物 细菌16s RNA通用引物： 27F：5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 1429R：5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 357F： 5