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* * 下面我们就先看一下层析技术中不同分离纯化介质的基球差异，各自的优缺点以及不同介质的市场占有率。 * 从市场占有率情况看，基于琼脂糖颗粒的分离纯化介质占据了分离纯化行业60-70%的市场，其中最具知名度，占据主要市场份额的品牌是GE Healthcare，也就是原安玛西亚公司。 第二大类分离介质为甲基丙烯酸盐颗粒介质产品，该类介质的典型代表是日本的Tosoh大有色谱公司，大有色谱的分离纯化介质产品以甲基丙烯酸盐颗粒产品为主。 市场中其余的竞争厂商还包括：Bio-Rad，他们提供基于琼脂糖的纯化介质，也提供一系列基于甲基丙烯酸盐的基质；Biosepra/Pall，其产品种类较多，既有纤维素，琼脂糖纯化基质，也提供甲基丙烯酸酯的纯化基质，该品牌在生物领域使用较少；Millipore公司的纯化介质产品以多孔玻璃珠基质为主；Applied Biosystems公司的介质则以聚苯乙烯二乙烯苯为主。 琼脂糖分离纯化介质具有一系列的优势，刚才我们已经介绍过琼脂糖的生物相容性好；琼脂糖颗粒由于其多孔性，孔容可达90%，琼脂糖分离纯化柱的柱结合载量高；琼脂糖的选择性强；化学稳定性好，琼脂糖教练结构可在相当大的pH范围内保持稳定；琼脂糖纯化介质的操作简便；琼脂糖颗粒交联后也可耐高压。这些优势使琼脂糖分离纯化介质成为目前生物大分子分离纯化领域中使用最广的分离介质。 当然琼脂糖介质也存在一定的缺陷，例如琼脂糖微球的刚性较差，需要高度交联才可耐高压；琼脂糖介质的价格较高，相较于纤维素微球，琼脂糖介质的成本较高。 * 凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。 当然凝胶过滤也存在一定的局限性，例如使用凝胶过滤纯化样品时，样品上样体积受到限制，同时样品经过纯化后浓度会被稀释。 凝胶过滤层析主要应用以下这些实验中，包括集团分离，也就是组群分离；样品脱盐，缓冲液交换，去除小分子；不同组分蛋白和多肽分离；复杂样品纯化特定单体或去除二聚体；此外还可使用凝胶过滤层析测定分子量及分子量分布。 通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出Ve或Kav对分子量对数的标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子量。凝胶层析测定分子量操作比较简单，所需样品量也较少，是一种初步测定蛋白分子量的有效方法。 下面就让我们来了解一下Bio-Works的凝胶过滤纯化介质产品。 WorkBeads SEC是琼脂糖以全新的方式高交联而成的纯化介质。这里列出了详细的Bio-Works凝胶过滤纯化介质的产品参数。 Bio-Works凝胶过滤层析介质的琼脂糖含量为7.4～7.8%，Bio-Works提供两种颗粒大小规格，分别为17um介质以及40um介质。17um介质的颗粒大小范围为 * GE Healthcare (原Pharmacia) Sephadex: 环氧氯丙烷与葡聚糖交联 Sepharose: 交联的琼脂糖凝胶 Superose:高交联的多孔琼脂糖凝胶 Superdex:葡聚糖与琼脂糖共价交联 Sephacryl: 葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺交联 Bio-Rad Laboratories BioGel P: 聚丙烯酰胺凝胶 BioGel A: 琼脂糖凝胶 * Results can be optimised via several factors Effect of pH on fractionation of model proteins 离子交换填料的结合能力 总离子载量 e.g. 140 - 200 μmol/mL ? 并不重要 有效载量 e.g. 25 mg HSA/mL ? 随着pH、样品、离子强度不同而变化动态载量 e.g. 25 mg HSA/mL, 300 cm/h ? 与流速有关 ? 也随着pH、样品、离子强度不同而变化 * * When you look at the curve remember that a 40 μm bead gives 5 times higher back pressure compared to a 90 μm bead ((90/40) squared) according to Blake-Kozenys?equation * * WorkBeads?40 ACT Activated Media for Preparative and Bioprocess Scale Affinity Chromatography with User’s Choice of Ligands ? Made