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过氧化氢酶的活力和动力学常数测定 - 生化实验技术
实验二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定;一、实验目的;二、实验原理;据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入过量的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
5 H2O2 +2KMnO4+4H2SO4 =5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4;酶促反应速度可用单位时间底物的减少量表示，即求出单位时间内反应前后H2O2浓度差，即可计算出酶促反应速度。
米氏方程的倒数形式，即双倒数作图法（LineweaveR-Burk法）如下：
[S]为底物浓度（mol/L）
v0为初速度（μmol/L*min）
vmax为最大反应速度（μmol/L*min）
Km为米氏常数（ mol/L）
用双倒数法（以1/v0对1/[S]作图）
计算米氏常数Km和最大反应速度vmax;三、材料、试剂与器具 ;高锰酸钾溶液标定：;（4）0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；
（5）0.1mol/L草酸钠：称取优级纯Na2C2O4 13.4g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。
;3.器具
（1）恒温水浴；
（2）研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；容量瓶25ml×1等;四、实验步骤;（二）酶活力的测定
1.反应
取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。
2.滴定
用0.02mol/L KMnＯ4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30s内不消失）为终点。;3.计算;（三）动力学常数的测定（vmax和Km）;用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶中剩余的H2O2至微红色，记录消耗的KMnO4溶液毫升数。
分别求出各瓶反应前后的底物浓度[S]0、[S]1，并计算反应速度v0：
[S]0=C1V1/10
[S]1=2.5C2V2/10
v0=(C1V1-2.5C2V2)/5
以1/v0对1/[S]作图
求出Km和Vmax
（用excel作图）;注意事项;六、研讨题
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