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5FU对SW480细胞Musashi1基因表达影响 　【摘要】 目的：观察5氟尿嘧啶（5FU）对人结直肠癌细胞株SW480的作用与Musashi1基因表达变化的关系。 方法 ：用MTT法检测不同时间5FU对SW480细胞增殖的 影响 ，流式细胞术检测侧群（SP）细胞和CD34＋CD44＋细胞比例，RTPCR半定量检测Musashi1基因表达。结果：5FU作用于SW480细胞24、48、72 h的半数抑制率依次为32.12、16.2和6.8 mg·L－1，SP细胞比例、CD34＋CD44＋细胞以及Musashi1 mRNA表达在5FU作用后均增加。结论：正常肠道干细胞标记物Musashi1有可能成为结直肠癌干细胞样肿瘤细胞特异性标记，CD34、CD44可能具有类似的潜力。 毕业论文 【关键词】 结直肠癌细胞株SW480；Musashi1基因；肿瘤干细胞；5氟尿嘧啶 本论文由中国收集整理，转载请注明出处　 结直肠癌是常见恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率有逐渐上升趋势。关于其发病机制存在众多假说，其中一种是“肿瘤干细胞假说”。该假说认为肿瘤中存在一小群具有干细胞功能的肿瘤细胞，被称为肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs），这些CSCs的存在可能是肿瘤发生的根本原因，同时也可能是肿瘤耐药的重要原因以及复发或转移的起源。已有 研究 证实正常肠道中存在隐窝干细胞，同时还证实Musashi1是其特异性的标记物。本实验将结直肠癌常用的化疗药物5氟尿嘧啶（5FU）作用于结直肠癌细胞株SW480，主要观察Musashi1表达改变。 论文代写 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 人结直肠癌细胞株SW480（ 中国 科学 院上海生命科学研究院细胞资源中心），RPMI 1640细胞培养基（GIBCO公司），胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司），四甲基偶氮唑蓝（MTT）、Hoechst 33342 (Sigma公司)，Trizol裂解液、逆转录聚合酶链反应（RTPCR）试剂盒（TaKaRa公司）。光学显微镜，CO2恒温箱细胞培养，生物超净工作台，酶标仪，流式细胞 分析 （FCM）仪，PCR仪。 毕业论文 　　1.2 方法 论文代写 　　1.2.1 细胞培养与实验分组 SW480细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，置于37℃、5%的CO2 培养箱中，每2～3 d传代1次，实验时取对数生长期细胞。浓度为7.5、15、30 mg·L－1 的5FU处理48 h后的SW480细胞和对照组SW480细胞依次设为A、B、C及D组，浓度为7.5、15、30 mg·L－1 5FU处理24 h后的SW480细胞依次设为E、F、G组。 毕业论文 　　1.2.2 MTT法 计算 抑制率 将SW480细胞5×104 ml－1 接种于96孔板，培养箱中孵育24 h后加入培养液稀释的5FU，5FU终浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50及100 mg·L－1，每个浓度设5个平行孔。另设阴性对照组和空白调零孔。培养箱中分别孵育24、48 h后加入MTT孵育4 h，自动酶标仪上测定OD570值。抑制率=（1－实验组平均OD570值/对照组平均OD570值）×100%。 毕业论文 　　1.2.3 FCM仪检测侧群（side population,SP）细胞比例[1] A、B、C及D组细胞均分置于两管中，分别记为1、2管，800 r·min－1 离心5 min；两管中均加入Hoechst 33342及2%胎牛血清的RPMI 1640培养液，使Hoechst 33342的终浓度为5μg·ml－1；仅在2管内加入维拉帕米并使维拉帕米的终浓度为50μmol·L－1，37℃水浴90 min。置于4℃以备FCM仪检测SP细胞比例。SP细胞比例＝1管中Hoechstlo比例－2管中Hoechstlo比例（这是由于SP细胞具有外排Hoechst 33342的能力，而维拉帕米可以拮抗SP细胞该功能）。 　　1.2.4 FCM仪检测细胞表面分子CD34及CD44的表达 将A、B、C及D组细胞以800 r·min－1离心5 min，分别加入20μl CD34、CD44单克隆抗体（B﹠D公司）（4℃，30 min），冰PBS洗涤1次，在FCM上检测CD34＋CD44＋细胞比例。 毕业论文 　　1.2.5 RTPCR半定量检测Musashi1 Trizol法提取 A、B、C、E、F、G及D组细胞的RNA，琼脂糖凝胶电泳初步评价RNA质量、分光光度仪测定总RNA纯度。按TaKaRa两步法试剂盒提供的说明书进行RTPCR操作，根据RNA纯度将每组的R