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Humanin基因克隆及序列测定 　 ; 作者：靳辉，王唯析，杨广笑，王全颖，胡海涛，韩太真 毕业论文 【关键词】; 阿尔茨海默病 毕业论文 ; 作者简介：靳辉(1973)，女(汉族),解剖学硕士. 研究方向：阿尔茨海默病的病理机制及防治. 毕业论文 　　摘要：目的; 利用基因工程方法对Humanin进行基因克隆并测定其序列，为进一步对阿尔茨海默病进行基因治疗奠定基础。方法; 采用非对称互补引物/模板法，制备两端含有酶切位点的Humanin的cDNA，将其克隆入pVAXI载体中并测序。结果; 经酶切鉴定、测序分析，表明所插入的基因片断为Humanin基因，与设计完全相同。结论; 成功地克隆了Humanin基因。 毕业论文 　　关键词：阿尔茨海默病；Humanin；基因克隆；序列测定 毕业论文 　　ABSTRACT: Objective; To use gene engineering technique to clone and sequence theHumanin. Methods; By means of asymmetrical primer/template, double stranded cDNA of Humanin was constructed, which had restriction enzymes sites on the two extremes. Then the cDNA was subcloned into the plasmid pVAXI and sequenced. Results; Evidences of DNA sequence analysis and restriction enzymes digestion showed that the inserted fragment wasHumanin cDNA, consistent with the fragment we designed. Conclusion; The Humanin cDNA was cloned successfully. 毕业论文 　　KEY WORDS: Alzheimer’s disease; Humanin; gene cloning; sequencing 毕业论文 ; 阿尔茨海默病(Alzheimers disease, AD)是以进行性的记忆减退、认知障碍和痴呆为临床表现的老年人常见疾病，发病率随着人口的老龄化而迅速增加，已成为继心血管疾病、癌症和中风之后的又一严重危害人类健康的疾病。目前世界各国均在积极寻找防治AD的有效措施。近年，日本学者首先从AD患者未发病的大脑枕叶分离出一种称为Humanin(HN)的短肽。它能有效抑制AD相关基因：淀粉样蛋白前体(amyloid precursor, APP)基因、早老素1(presenilin1, PS1)基因、早老素2(presenilin2, PS2)基因的突变，以及β淀粉样肽(amyloid peptide, Aβ)引起的神经细胞死亡，且Humanin的一种衍生物――Humanin(HNG)，被证实作用较HN强1000倍。迄今，Humanin及其衍生物的作用机制仍不十分清楚。为了深入研究其对AD的作用机制以及为开发新的更为有效的抗AD药物提供参考，我们首次在国内对HNG进行基因克隆。 毕业论文 　　1; 材料与方法 毕业论文 　　1.1; 材料; 大肠杆菌E.coli DH5α、质粒载体pVAXI 由西安华广生物工程公司提供。限制性内切酶KpnⅠ、XhoⅠ、SalⅠ及T4 DNA连接酶，均购自华美生物工程公司。 毕业论文 　　1.2; HNG DNA 的设计与合成; 根据Hashimoto等人提供的HN基因序列，将其第14位丝氨酸碱基AGT换为甘氨酸碱基GGG，形成HNG基因序列，在其前后分别加入质粒载体pVAXI多克隆位点上的两个单一酶切位点KpnⅠ和XhoⅠ，并在HNG基因编码区的下游引入了一个载体上没有的酶切位点SalⅠ。设计HNG非全长、部分互补的两条单链DNA，使其互为引物、互为模板制备全长HNG cDNA。序列如下：正链：CGGTACCATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCGGGGAAATTG；负链：GCCTCGAGCGTCGACTGCCCGCCTCTTCACGGGCAGGTCAATTTCCCCGG(正链中GGTACC为KpnⅠ酶切位点，GGG为第14位甘氨酸的编码碱基；负链中CTCGAG、GTCGAC分别为XhoⅠ、SalⅠ酶切位点；下划线部分为12个互补碱基)。以上序列均由上海生物工程有限公司合成，PAGE纯化。 毕业论文