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Marfan综合征FBN1基因新剪接位点置换突变 　 作者：伍严安, 陈喜军, 黄肖利, 陈同, 陈发文, 陈发林, 黄毅 【关键词】 马凡综合征;,原纤维蛋白 　　摘要: 目的 对Marfan综合征(MFS)患者的原纤维蛋白1基因(FBN1)进行突变筛查,探讨MFS患者新的FBN1突变。 方法 应用聚合酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱法(DHPLC)对1例MFS患者FBN1的65个外显子进行突变筛查,对DHPLC图形异常的PCR扩增片段用DNA测序鉴定突变位点及性质。用限制性片段长度多态性分析法(RFLP)进一步证实突变。 结果 发现1种新的FBN1剪接位点的置换突变(Intron29+4Agt;T)。 结论 FBN1的Intron29+4Agt;T可能为该MFS患者的发病原因。 　　关键词: 马凡综合征; 原纤维蛋白1; 基因; 突变; 色谱法，高效液相； 多态性，限制性片段长度 　　马凡综合征(Marfan syndrome,MFS)是一种常染色体显性遗传性结缔组织病,发病率为1/(5 000~10 000),25%~30%患者为散发病例。MFS主要累及心血管、骨骼和眼等系统或器官,临床表现有夹层主动脉瘤、二尖瓣脱垂、蜘蛛脚样指趾、晶状体异位等。MFS还可累及肺、皮肤和中枢神经系统等器官或系统,临床表现有自发性气胸、皮肤不能解释的牵拉体征和腰骶部硬脊膜的扩张等。原纤维蛋白1(fibrillin1)基因(FBN1)全长约235 kb,由65个外显子构成,定位于15q21.1。其mRNA包含9 749个核苷酸。自1991年Dietz等提出FBN1突变是MFS的致病原因以来,发现的FBN1突变有601种,分布于整个FBN1。原纤维蛋白1为相对分子质量320 kD的糖蛋白,由2 871个氨基酸组成,是构成细胞外微纤维(直径10~12 nm)的主要蛋白之一。因此FBN1突变将影响微纤维的结构与功能[12]。近几年发现另1种与MFS有关的基因――转化生长因子β受体2(transforming growth factor beta receptor type Ⅱ,TGFBR2)基因[3]。笔者采用聚合酶链反应(PCR)、变性高效液相色谱(denaturing highperformance liquid chromatography,DHPLC)异源双链分析与DNA测序等方法,对1例MFS患者进行FBN1突变筛查与鉴定,探讨新的FBN1突变。 　　1 对象与方法 　　1.1 对象 先证者,女,12岁,以“突发心悸、胸闷半天”于2003年11月入福建省立医院心外科。患者身高170 cm,肢展173 cm,体质量37 kg,有蜘蛛样指征。心脏二维彩超示主动脉窦部增宽,主动脉瓣呈二叶启闭及返流（＋）,二尖瓣脱垂;有晶状体异位和高度近视，临床诊断为MFS。该患者有家族史,其母有身材瘦高,双眼白内障和晶状体异位等MFS临床表现。其父临床表型正常。50名无关正常人为对照组。 　　1.2 方法 　　1.2.1 基因组DNA抽提 取患者静脉血2 mL,EDTA抗凝,用全血DNA抽提试剂盒(德国Qiagen公司)抽提基因组DNA。 　　1.2.2 聚合酶链反应(PCR) 对FBN1的65个外显子进行PCR扩增。引物由美国Johns Hopkins大学医学院Dietz教授惠赠。引物分别位于外显子两侧的内含子区域。其中第29外显子 　　正向:5CAGACATCCAAACCATATCAG3’ 　　反向:5GAACCTACTGAGAGATTCAAC3’ 　　PCR反应体系50 μL,含0.2 mmol/L dNTP,1.5 mmol/L Mg2+,DNA模板200 ng, Ex Taq DNA聚合酶(日本TaKaRa公司)1.25 U,0.4 μmol/L引物。用基因扩增仪(Hema 240,珠海黑马医学仪器公司)进行PCR反应。反应条件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s→55~61 ℃ 30 s→72 ℃ 50 s,共30个循环;72 ℃最后延伸10 min[34]。PCR产物用含0.5 μg/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。 　　1.2.3 DHPLC筛选FBN1突变 用DHPLC系统(美国Transgenomic公司)对PCR反应产物进行筛选突变分析[5]。 　　1.2.4 DNA测序 用全自动测序仪(ABI 377型,美国Applied Biosystems公司)对DHPLC图形异常的PCR产物进行DNA序列测定。 　　1.2.5 限制性片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism,RELP) 用RFLP进一步鉴定FBN1的Intron29+4Agt;T。第29内含