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nell1基因直接体内转染修复犬下颌骨缺损 　【摘要】 目的: 探讨含Nell1基因逆转录病毒液与聚羟基丁酸酯(PLGA)生物材料复合后修复犬下颌骨缺损的效果. 方法: 制备含Nell1真核细胞表达载体的逆转录病毒液PTPLNCX2Nell1. 制备比格犬下颌骨15 mm×10 mm×5 mm的箱状缺损模型，修复实验分为2组：PTPLNCX2Nell1+PLGA修复组（实验组）， PLGA修复组（对照组）, 每组8个样本, 分别于术后8，16 wk进行大体观察、X线检测和组织学检测. 结果: PTPLNCX2Nell1重组病毒液与生物材料复合修复组可见在骨缺损处有骨性连接形成，骨缺损修复，组织学观察见有大量新生骨组织形成； PLGA修复组未见骨性连接形成，仅在部分骨缺损两断段形成少量骨组织. 结论: 利用Nell1基因体内局部、直接转移的方法能够用于犬下颌骨缺损的修复. 【关键词】 Nell1基因；骨缺损；基因转染 　　0引言 　　近年来基因转移技术在骨组织再生、骨缺损研究中的作用越来越受到重视，将相关生长因子通过体外转移或体内直接转移的方法能够新生骨组织. Nell1是一种具有较强成骨活性的生长因子，其成骨能力已得到证实［1］. 用逆转录病毒介导的方法可以将Nell1蛋白转入犬骨髓间充质干细胞(BMSc)中，在获得外源Nell1表达的同时，BMSc的成骨活性也得到显著提高. 但含有Nell1基因的逆转录病毒液在体内是否具有诱导成骨活性、其形成骨组织并修复骨缺损的能力仍需验证. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　比格犬为广东省医药工业研究所提供；逆转录病毒基因载体转移系统试剂盒：包括PLNCX2逆转录病毒载体、PT67包装细等（Clontech，美国）；限制性内切酶：Sal I Sma I（New England Biolab，美国）. 　　1.2方法 　　1.2.1Nell1逆转录病毒液的制备 　　使用Sal I酶切PBSKNell1 (American Tisue Culture Collection)和PLNCX2逆转录病毒载体(Clontech)，黏端连接后提取质粒进行酶切鉴定(Sma I酶切)，筛选出正确插入的重组质粒PLNCX2Nell1. 使用脂质体转染PLNCX2Nell1包装细胞PT67，使用G418筛选至阳性克隆形成，将阳性克隆细胞进行扩增，收集培养上清液，命名为PTPLNCX2-Nell1病毒液. 　　1.2.2生物材料的制备 　　聚羟基丁酸酯(PLGA)生物材料由中国科学院化学研究所制备并惠赠. 材料呈多孔块状，参数基本如下：孔径为200~300 nm，孔隙率大于90％，将生物材料修剪成体积为0.2 cm×0.2 cm×1.5 cm长条状. 使用750 mL/L乙醇浸泡，无菌0.1 mol/L PBS反复冲洗并浸泡后，紫外线下晾干，封装备用. 用于骨缺损修复实验前取1 mL PLNCX2-Nell1病毒液浸泡生物材料24 h. 单纯材料修复组用相应细胞培养基浸泡. 　　1.2.3犬下颌骨缺损修复 　　实验动物选择健康比格犬8只，雌雄不拘, 体质量13～15 kg, 年龄1~1.2岁，适应性饲养2 wk. 按自身同期对照研究的设计原则，在犬下颌骨上设计两个15 mm×10 mm×5 mm的全层箱状缺损，在其中一个植入相应大小的PTPLNCX2Nell1＋ PLGA复合材料，另一侧植入单纯PLGA作为对照. 实验方法：以846合剂和氯胺酮1∶1混合后，按混合液中846合剂的0.12~0.15 mg/kg肌肉注射. 用金刚砂切片切开骨皮质，用牙科台式电钻于犬下颌骨下缘中份骨皮质上造成两个长15 mm，宽10 mm，深5~6 mm的箱状缺损，术中应避免伤及下颌神经血管束，保留骨膜，在其中一个缺损内放入相应大小的PTPLNCX2Nell1＋ PLGA复合材料，另一缺损植入单纯PLGA，分层缝合创口. 术后肌注青霉素80万U，庆大霉素4万U，2次/d，4 d，预防感染. 术后分笼常规饲养. 　　1.2.4检测方法 　　大体形态观察：术后8，16 wk取骨缺损修复标本进行大体观察，观察骨缺损部位骨组织再生情况、修复程度以及有无炎症反应. X线观察：分别于8，16 wk进行X线检测，观察各组骨缺损区骨痂生长和骨连接情况. 组织学切片观察：标本经40 g/L多聚甲醛固定后EDTA脱钙，石蜡包埋、切片，常规HE染色，显微镜下观察. 　　2结果 　　2．1动物一般情况 　　动物术后2 h内苏醒，1 wk内均恢复正常饮食，术后3~7 d术区局部组织肿胀明显，2 wk后伤口逐渐愈合，肿胀也逐渐消失，仅缝线处有轻微红肿，缝线1~2 mo后部分自行脱落.