复元胶囊抑制骨关节炎大鼠软骨及血清白细胞介素-6实验探究.docVIP

复元胶囊抑制骨关节炎大鼠软骨及血清白细胞介素-6实验探究 　【摘要】 目的观察复元胶囊对大鼠骨关节炎(OA)软骨及血清白细胞介素(IL-6)的影响，探讨其抗OA的作用机制。方法Hulth法建立OA模型，随机分为模型组，复元胶囊高、中、低剂量组，同时设对照组。于治疗第4，8，12周取软骨及血清标本，大体观察、Mankins评分、免疫组化测定软骨中IL-6表达、酶联免疫吸附法测定血清中IL-6水平，并将软骨及血清IL-6含量与Mankins评分指数进行相关分析。结果复元胶囊各组关节软骨Mankins评分、软骨及血清中IL-6水平均低于模型组(P﹤0.01);复元胶囊各组Mankins评分差异具有显著性(P﹤0.05);模型组及复元胶囊各组软骨及血清中IL-6水平第8周高于4周(P﹤0.01)、12周高于8周(P﹤0.05);软骨及血清中IL-6水平与Mankins评分指数呈正相关，相关系数分别为r=0.98(P﹤0.01)，r=0.96(P﹤0.01)。结论复元胶囊对大鼠OA软骨及血清中IL-6具有剂量依赖的抑制作用;软骨及血清中IL-6水平与关节病理改变的Mankins评分指数呈正相关。 【关键词】 骨关节炎; 复元胶囊; 白细胞介素-6; 大鼠 骨关节炎(osteoarthritis，OA) 是中老年人常见的慢性、进展性关节疾病，是导致老年人群关节残疾的主要原因。OA以关节软骨退化和破坏为主要病理特征，其发病与衰老、外伤、炎症、代谢、免疫、遗传、过度运动等多种因素有关，但确切发病机制尚不清楚。研究发现，白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)参与介导骨关节炎的免疫及炎症反应，是OA发展中重要的炎症介质。在骨关节炎患者软骨组织及血清中，IL-6含量明显升高，并与病情严重程度相关[1,2]。复元胶囊(Fuyuan capsule,Fyc)为一临床治疗OA的有效复方，前期研究表明，其可减轻软骨病变，抑制IL-1表达[3]。本文主要研究复元胶囊对骨关节炎大鼠软骨及血清IL-6的影响，探讨其抗OA的作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 药品试剂复元胶囊(由重庆希尔安药业公司生产)主要成分为鹿角胶、淫羊霍、黄芪、人参、三七粉、川芎等中药组成，每粒0.41g，每克粉末含生药3g。大鼠IL-6免疫组化试剂盒及ELISA试剂盒由武汉博士德生物科技有限公司提供。 　　1.2 实验方法 雄性SD清洁级大鼠60只，9～10周龄，体质量(300±10)g，由重庆医科大学实验动物中心提供。随机选12只为对照组，行皮肤切开后缝合;其余48只为造模组，采用Hulth法[4]造模。将大鼠用5%水合氯醛按0.7 ml/100 g(体质量)腹腔注射麻醉，无菌条件下剪断内侧副韧带及前后交叉韧带，完整切除内侧半月板，逐层缝合，无菌包扎。术后予青霉素8×104 U·kg-1·d-1,肌肉注射7 d。术后1周将造模动物随机分为模型组，复元胶囊高、中、低剂量组，每组12只，每天驱赶大鼠跑步30min。分别于给药4，8，12周各组随机处死4只大鼠，取血清及软骨标本。 　　1.3 给药方法根据Meeh—Rubner公式计算复元胶囊给药剂量。复元胶囊高、中、低剂量组给药量分别为：371.65，743.30，2 229.90mg·kg-1·d-1;分别配成2 ml溶液于造模后1周开始灌胃。模型组及对照组给予生理盐水2 ml。 　　1.4 观察指标 　　1.4.1 大体观察关节软骨取软骨标本，观察关节囊、滑膜、关节软骨大体形态及有无关节积液，并按以下原则评分：关节面光整，色泽正常为0分;关节面粗糙，有裂隙，色泽灰暗为1分;关节面糜烂，软骨缺损达软骨表中层为2分;关节面溃疡形成，软骨缺损达软骨深层为3分;软骨剥脱，软骨下骨暴露为4分。 　　1.4.2 光镜观察关节软骨取股骨内髁全层软骨及胫骨平台软骨标本置于4%多聚甲醛溶液中固定，10%EDTA脱钙2周，常规石蜡包埋，切片HE染色观察软骨组织的结构、细胞数量和潮线的完整性。依据Mankins评分标准进行评分。 　　1.4.3 免疫组化检测软骨IL-6表达待检软骨标本常规石蜡包埋，连续切片5 μm，捞片于多聚赖氨酸防脱处理过的载玻片上，切片脱蜡至水，3%H2O2室温10 min灭活内源性过氧化物酶。冲洗后PBS浸泡5 min，复合消化液修复抗原活性。正常血清封闭，滴加1∶100稀释抗大鼠IL-6抗体(武汉博士德)，4℃孵育过夜。PBS冲洗5 min，3次。滴加生物素标记的二抗(美国SantaCruz公司)，37℃孵育20 min，PBS冲洗5 min，3次。滴加SABC—HRP(美国santa Cruz公司)，37℃孵育20 min。PBS冲洗5 min，3次。二甲基联苯胺(DAB)室温下显色至满意，自来水终止显色反