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复合酶法提取板党多糖探究 　 作者：周大寨，朱玉昌，黄卫，张弛 【摘要】 　　目的将现代酶解技术应用于板桥党参多糖的提取，筛选出最佳提取工艺。方法以板党多糖得率为指标，先考察木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶各自最适当的酶用量、酶解时间、酶解pH及酶解温度，再通过正交实验和方差分析确定复合酶法提取板党多糖的最佳条件。结果在木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的酶用量分别为90，90，150 U/g干粉复合下，pH5.0、50℃酶解90 min，板党多糖得率最高，达26.47%。结论采用酶解辅助提取板党多糖，可以明显提高多糖的提取率。 【关键词】 板党 多糖 复合酶 党参Radix Codonopsis是我国传统常用中草药，为中药“八参”之首，具有补中益气、和胃养血等功效，其中党参多糖作为主要的药物活性成分，一直是党参品质鉴定的主要指标，其能提高小鼠脑SOD活性，降低MDA含量，有助于清除体内自由基，且能提高机体的免疫能力，可以抗衰老［1～3］。本研究以板桥党参（简称“板党”）为原料，利用酶法技术提取板党多糖，以提高多糖的得率，提高产品的科技含量及附加值，为进一步开展其药用及保健方面的开发应用奠定基础。 　　1 材料与仪器 　　1.1 材料板桥党参，由恩施市峰岚板桥党参有限公司提供，实验室纯化。 　　1.2 仪器与试剂TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；pHSJ-4A型实验室pH计（上海精密科学仪器有限公司）；HWS12型电热恒温水浴锅（上海—恒科技有限公司）；S21-3磁力搅拌器（上海司乐仪器厂）；DL6MB型大容量冷冻离心机（长沙科威实业有限公司）。 　　木瓜蛋白酶（国药集团化学试剂有限公司，酶活6000U/mg）；纤维素酶（国药集团化学试剂有限公司，酶活15000U/g）；精制果胶酶（天津市利华酶制剂厂，酶活20000U/g）；所用其他化学试剂均为国产分析纯。 　　2 方法 流程： 粉粹板桥党参，过40目筛，60℃干燥2 h。称取100 g置500 ml圆底烧瓶，加石油醚250 ml，77℃回流1 h脱脂，过滤，石油醚回收，滤渣挥干溶媒，加250 ml 80%乙醇浸渍过夜。 86℃回流提取2次，1.5 h/次，过滤，滤渣挥干溶媒。 准确称取0.2 g处理样品，加蒸馏水100 ml，调pH，升温，加入酶，不同条件下酶解，离心，滤液加95%乙醇使醇含量达80%，冰箱静置过夜。 适量水溶解，加入3倍体积Seveage试剂，振荡，静置，分液，再进行两三次振荡分离后醇析过夜。 定容，硫酸苯酚法［4］测定多糖含量，计算提取率。 　　3 结果 　　3.1 单酶酶解条件的确定 　　3.1.1 最适酶用量的确定准确称取0.2 g样品6份，分别放入具塞三角瓶中，加蒸馏水100 ml，调pH6.0，依次分别加入酶用量0，30，60，90，120，150 U/g干粉，50℃恒温水浴浸提120 min后迅速升温至90℃灭酶10 min，流动水冷却至室温，离心，醇析，除蛋白，测多糖含量，计算多糖得率。结果见图1。 　 由图1可见，添加木瓜蛋白酶、纤维素酶及果胶酶在一定程度上均可提高板党多糖的得率。对于木瓜蛋白酶和纤维素酶，其添加量在30～90 U/g干粉范围，随着酶添加量的增加，多糖的得率呈上升趋势，当酶添加量大于90 U/g干粉后，多糖的得率不再增加，反而有下降的趋势；而果胶酶的添加量在120 U/g干粉时方使多糖得率达最高，因此，确定木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶各自的最适加酶量分别为90，90和120 U/g干粉。 　　3.1.2 最适酶解时间的确定准确称取0.2 g样品7份，分别放入具塞三角瓶中，加蒸馏水100 ml，调pH6.0，酶用量木瓜蛋白酶和纤维素酶均为90 U/g干粉，果胶酶120 U/g，干粉50℃恒温水浴分别浸提0，30，60，90，120，150，180 min后迅速升温至90℃灭酶10 min，流动水冷却至室温，离心，醇析，除蛋白，测多糖含量，计算多糖得率。结果见图2。 　 从图2可知，随着提取时间的延长，板党多糖得率呈上升趋势，但总提取时间在木瓜蛋白酶达150 min，纤维素酶达120 min，果胶酶达60 min后，多糖得率随时间增长而下降。一方面，随着酶解时间的延长，板党细胞壁及细胞间层的纤维素阻挡层已被有效破解，糖类物质大多已从细胞内扩散到溶液中，细胞内外的多糖浓度已达到了一种动态平衡；另一方面，酶促反应的产物，如纤维二糖、葡萄糖、半乳糖醛酸等在溶液中浓度的积累会对酶促反应造成抑制。 　　3.1.3 最适酶解pH的确定准确称取0.2 g样品7份，分别放入具塞三角瓶中，加蒸馏水100 ml，依次调pH3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，酶用量木瓜蛋白酶和纤维素酶均为90 U/g干粉