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小发夹RNA介导基因沉默及其应用 　 【关键词】 RNA干扰；shRNA；基因功能分析；基因治疗 发夹结构的RNA（hairpin RNA）是RNA二级结构中最简单的。它是由一条RNA单链自身折叠，形成双链的茎，再加上一条单链的环构成，因此，发夹结构RNA又称为茎环结构RNA，在整个生物界中普遍存在。最近，一类特殊的发夹RNA小发夹RNA显示参与了转录后基因表达的调控，这些shRNA在基因稳定沉默中起重要的作用。shRNA介导的RNA干扰技术已经成为研究哺乳动物细胞体内外基因功能强有力的工具。 1 siRNA、stRNA、miRNA与RNAi RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)是RNAi过程中重要的中间分子，是一类长约21～23个核苷酸(nt)的特殊双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)分子，与所作用的靶mRNA序列具有同源性，RNAi主要是通过dsRNA被核酸酶切割成siRNA， 再由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现。 最近，在线虫和蠕虫中发现了lin4和 let7 RNA，这两种RNA均来自于72nt具有发夹结构的前体RNA，经加工形成22nt的RNA。lin4和 let7基因与发育的时序性有关，一旦突变，会引起异时序性的发育缺陷。因其与发育的时序有关，所以称它们为stRNAs(small temporal RNAs) ［1］。同时在不同的生物体中，也已发现90多种发夹结构RNA，可产生21～23nt RNA，但它们不象lin4和 let7 一样时序性表达，因此将它们统称为 miRNAs(microRNAs) ［2］。 stRNA、miRNA、siRNA及RNAi有何关系呢？研究发现，Dicer酶将siRNA和stRNA联系起来，Dicer酶可催化长dsRNA分解成siRNA，同时还能将稳定发夹结构的前体RNA分解成21～23nt的stRNA。当用siRNA将Hela细胞中的Dicer消除时，会发生72nt未加工的let7前体RNA的积累。同样，在蠕虫中去除Dicer酶，会引起发育的异时性，也会发生未加工的let7和lin4前体RNA的积累［1］。eIF2C/Argonaute家族是RNAi和stRNA的又一联系者。当蠕虫eIF2C/Argonaute家族中特异蛋白缺陷时，其发育呈异时性表型，同时未加工的lin4和let7前体RNA积累［3］。在植物体中，miRNA的作用机制与siRNA介导的mRNA降解相似。用免疫沉淀法发现两种与SMN复合体（survival of motor neurons complex）密切相关的蛋白GEMIN3和GEMIN4。miRNA和GEMIN3/4复合体包含了与Argonaute 同源的eIF2C和Dicer酶［4］。因此，这一研究进一步揭示了内源性发夹miRNA与RNAi的关系。 2 shRNA介导的RNAi 长发夹结构的RNA(500～1000nt)分析基因功能的技术在低等生物中已大获成功。在哺乳动物中，这种技术已在小鼠的胚胎干细胞中取得进展。然而，在不同的哺乳动物体细胞中，试图用如此长的发夹结构RNA以介导持续的基因沉默，目前尚未成功。可能是因为长发夹结构RNA活化了干扰素（IFN）相关途径，对基因表达缺乏特异性。为避免IFN反应，人们正在试图用短的dsRNA结构来沉默靶基因。研究发现，小于30 个nt的dsRNA能特异性抑制基因表达，而不会造成非特异性作用。在哺乳动物细胞中，shRNA可以长期甚至稳定的发挥RNAi的作用，而不引起非特异性反应。因此如何得到shRNA是维持长期RNAi作用的关键。已有研究者发展了基于DNA载体在体内表达shRNA的技术。采用事先在体外构建能够表达shRNA的载体，再转移到细胞内转录shRNA的策略。在所构建的siRNA表达载体中，由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成，是因为RNA聚合酶Ⅲ一方面在体内有较高的转录效率，另一方面有明确的起始和终止序列。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3端形成1～4个U，这样就限制了RNA的大小，不会引起干扰素的非特异作用。已有研究者应用聚合酶Ⅲ启动子鼠U6、人U6、H1RNA及ValtRNA启动子成功构建了siRNA表达载体［5～8］。 为找到决定发夹结构最佳效率的因素，有研究者观察了不同长度的茎和环构建的shRNA对RNAi效果的影响。结果发现，shRNA茎在18～29个核苷酸长度时，其RNAi的效果相当，无明显差异，但当超过29个核苷酸时，可能