抗人转铁蛋白受体单克隆抗体体外抗瘤效应探究.doc

抗人转铁蛋白受体单克隆抗体体外抗瘤效应探究 　 作者：沈昕, 邢薇, 何峰容, 李黎, 刘静, 朱慧芬, 雷萍, 沈关心 【摘要】 　　目的: 探讨抗人转铁蛋白受体(TfR)单克隆抗体（mAb）体外抗瘤效应。方法: 采用CFSE染色、 PIAnnexin Ⅴ染色和PI染色, 通过流式细胞术分析抗人TfR mAb对高表达的人肝癌细胞系HepG2和人乳腺癌细胞系MCF7增殖、凋亡和周期的影响; 通过MTT法检测抗人TfR mAb联合化疗药物对HepG2和MCF7细胞增殖的抑制作用。结果: 抗人TfR mAb能抑制HepG2和MCF7细胞的增殖, 并诱导其凋亡和S期阻滞; 与化疗药物联用可增强其对肿瘤细胞增殖的抑制作用。结论: 抗人TfR mAb具有良好的体外抗瘤效应。 【关键词】 转铁蛋白受体 单克隆抗体 体外抗瘤效应 　　转铁蛋白受体（transferrin receptor, TfR）, 即CD71分子,是细胞获得铁元素的关键性分子。由于TfR是细胞增殖所必须的, 而且在快速生长的肿瘤细胞表面稳定性的高表达[1], 因而成为肿瘤生物治疗的一个相对特异性的靶点。针对TfR的治疗性抗体发展迅速, 并在体内、 外的抗瘤研究中取得了良好的效果。但有研究显示, 不同的TfR抗体的生物学活性不尽相同[2]。我室所获得的抗人TfR单克隆抗体（mAb）可以特异性识别人肿瘤细胞表面TfR胞外端, 并具有较高的亲合力, 前期实验显示其对人红白血病细胞系K562具有明显的抗瘤作用[3]。在此我们进一步观察抗人TfR mAb对高表达TfR的人肝癌细胞系（HepG2）和人乳腺癌细胞系（MCF7）的增殖、 周期和凋亡的影响; 以及与临床常用化疗药物[5氟尿嘧啶（5FU）、 阿霉素(ADM)]是否存在协同抗瘤作用, 为临床应用研究提供实验依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 抗人TfR mAb为本室所收藏的分泌抗人TfR杂交瘤细胞株, 经诱生BALB/c（nu/nu）裸鼠腹水, DEAESephadex A50纯化, SDSPAGE电泳鉴定。羧基荧光素二酯酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）、 碘化丙啶（PI）、 四甲基偶氮唑蓝（MTT）、 二甲亚砜（DMSO）均为Sigma公司产品。PIAnnexin Ⅴ细胞凋亡检测试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品。5FU为浙江海正药业有限公司产品。ADM为法玛西亚有限公司产品。人肝癌细胞系HepG2和人乳腺癌细胞系MCF7均由本实验室保存。 　　1.2 方法 　　1.2.1 CFSE染色检测肿瘤细胞增殖 分别收集对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞, 用冰冷的PBS液洗涤2次后, 调整细胞密度为5×109/L, 取1 mL加入1 μL CFSE（终浓度为1 μmol/L）置于37℃, 孵育30 min。加入1 mL小牛血清终止染色, 再用冰冷的PBS洗涤3次后接种于24孔培养板中（5×104/孔）。并预留1×106个染色后的细胞作为母代细胞, 40 g/L多聚甲醛固定后4℃避光保存, 待上机。待细胞贴壁后分别加入抗人TfR mAb至终浓度为20、 40、 60、 80和100 mg/L, 每种浓度重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG作为对照。作用72 h后, 收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤后, 采用流式细胞仪FACS检测, 并利用ModFit LT for Mac Ⅴ3.0软件进行参数获取和数据分析。 　　1.2.2 PIAnnexin Ⅴ染色检测肿瘤细胞凋亡 分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于24孔培养板中（5×104/孔）, 加入抗人TfR mAb至终浓度为60 mg/L, 重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG作为对照。作用72 h后, 收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤2次后, 按PIAnnexin Ⅴ细胞凋亡检测试剂盒说明书操作, 采用流式细胞仪FACS检测, 并利用CellQuest软件进行参数获取和数据分析。 　　1.2.3 PI染色检测肿瘤细胞周期 分别取对数生长期的HepG2细胞和MCF7细胞接种于24孔培养板（5×104/孔）, 加入抗人TfR mAb至终浓度为60 mg/L, 重复3孔。并设相同浓度的非特异性鼠源性IgG作为阴性对照。作用72 h后, 收集各组细胞。用冰冷的PBS液洗涤2次后, 加入预冷的700 mL/L乙醇固定细胞4℃过夜。流式检测前用PBS液洗去固定液, 加入0.5 mL的PI综合染液（含50 g/L RNA酶）, 避光染色30 min后, 采用流式细胞仪FACS检测, 并利用ModFit LT for Mac Ⅴ3.0软件进行参数