抗迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体重链可变区基因克隆及序列分析.doc

抗迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体重链可变区基因克隆及序列分析 　 ; 作者：秦红, 黄威权，杨向民, 温伟红, 杨安钢、 毕业论文 【关键词】; 迟缓爱德华菌;,抗独特型抗体;,基因克隆;,序列分析 毕业论文 　　[摘 要]; 目的: 克隆并分析迟缓爱德华菌抗独特型单克隆抗体（mAb） VH基因。方法: 从分泌迟缓爱德华菌抗独特型mAb的杂交瘤细胞株（1E11）中提取总RNA, 利用RTPCR技术,扩增迟缓爱德华菌抗独特型抗体VH基因, 并将其克隆到PBSTvector中进行序列分析。结果: VH基因的全长序列为339 bp, 编码113个氨基酸。通过NCBI/BLAST/N和IMGT数据库（Lefrance, 2001）分析表明, VH基因符合小鼠IgG V区基因的特征: 含有4个框架区（FR）, 3个抗原互补决定区（CDR）及两个抗体特征性的半胱氨酸。结论: 成功地克隆了迟缓爱德华菌抗独特型mAb VH基因, 为进一步构建迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗奠定了基础。 毕业论文 　　[关键词]迟缓爱德华菌; 抗独特型抗体; 基因克隆; 序列分析 毕业论文 　　迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda) 是淡、 海水养殖鱼类的一种最主要的病原菌[1], 具有很强的致病性, 其感染具有流行面积广、 发病率及死亡率高等特点, 是水产养殖业中危害最大的一种疾病。该菌的宿主范围较广泛, 常能从多种冷血动物、 鸟类、 温血脊椎动物及环境中分离出[2], 可引起人类的各种感染（胃肠炎、 败血症、 肝脓肿、 脑膜炎、 伤口感染等）。临床表现为腹泻、 水样便、 伴呕吐、 腹痛及低热等。此外, 亦有报道迟缓爱德华菌可引起肝脓肿、 脑膜炎及软组织感染等的报道[3]。目前, 国内对该菌的治疗仍然是应用各类抗生素等药物, 如在饵料中添加适量的土霉素、 四环素、 庆大霉素、 氯霉素、 呋喃唑酮和磺胺类药物等, 并定期用福尔马林药浴。但长期应用抗生素易产生耐药性和药物残留等负面影响[4, 5]。欧、 美等国家已有将弧菌、 气单胞菌及爱德华菌等制成灭活疫苗, 并从中提取多糖、 胞外蛋白等有效抗原, 制备了单克隆抗体（mAb）工程疫苗, 且已商品化生产。由于灭活疫苗的抗原性较弱, 而减毒疫苗的安全性不稳定, 为此, 研制使用方便、 高效、 易商品化大规模生产、 切实有效的疫苗, 对水产业甚为必要。我们首次从分泌抗迟缓爱德华菌独特型mAb的杂交瘤细胞株（1E11）中提取总RNA, 并以RTPCR成功克隆了该mAb的VH基因。 毕业论文 　　1; 材料和方法 毕业论文 　　1.1; 材料; 分泌抗迟缓爱德华菌独特型mAb的杂交瘤细胞株（1E11）为本室建立[6]。RPMI1640干粉为Gibco BRL公司产品。RNA抽提试剂TRIzolTMReagents购自TaKaRa公司。RTPCR试剂盒为美国Invitrogen公司产品。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒, 均购自北京博大泰克公司。PCR试剂, 连接试剂和pBSTvector均购自北京天为时代公司。 毕业论文 　　1.2; 方法; 迟缓爱德华菌抗独特型mAb VH基因的扩增: 复苏分泌抗迟缓爱德华菌独特型mAb的杂交瘤细胞株（1E11）, 传至3代使细胞数目达2.8×107/L后收获细胞。用TRIzolTMReagents、 氯仿和异丙醇抽提RNA后, 以无水乙醇沉淀。以11 μL RNA为模板, 以Oligo（dT）20为随机引物, 反转录合成cDNA第1链。PCR引物序列: Back: 5′ATGAAATGCAGCTGGGGCAT(C,G)TTCTTC3′; For: 5′CAGTGGATAGACAGATGGGGG3′。在25 μL反应体系中, 加入cDNA 2 μL, Back和For引物各1 μL进行PCR。反应参数为: 于94℃变性5 min后, 94℃、 1 min, 50℃、 1 min, 72℃、 1 min, 共25次循环后, 于72℃再延伸10 min。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。 毕业论文 　 　　2; 结果 　　2.1; RTPCR扩增产物的鉴定; 经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定表明, VH基因的RTPCR产物大小为420～500 bp（图1）。 毕业论文 　　图1; mAb 1E11 VH基因RTPCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析（略） 毕业论文 　　1: DL 2000 DNA marker; 2: VH基因的RTPCR产物. 毕业论文 　　2.2; VH基因的克隆及序列分析; 将PCR扩增的VH基因胶回收后, 克隆入pBSTvector载体中, 并转化E.coli DH5α的感受态细胞中,