散发性阿尔茨海默病患者BDNF基因G196A及C270T单体型及双体型分析.doc

散发性阿尔茨海默病患者BDNF基因G196A及C270T单体型及双体型分析 　 作者：钱云，张志珺，张晓斌，袁勇贵，宇辉，施咏梅，柏峰，谢春明 【摘要】 目的：探讨脑源性神经营养因子（BDNF）基因G196A和C270T单核苷酸多态性（SNPs）在散发性阿尔茨海默病（sAD）发病机制中的作用。方法：采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，对105例sAD患者和105例健康对照者BDNF基因、载脂蛋白E(ApoE)基因多态性进行分析。结果：(1)sAD患者C270T但非G196A基因型及等位基因频率与对照组相比差异有统计学意义(P=0.034，P=0.011)。(2)BDNF G196A和C270T单体型分析发现，4种单体型在sAD组和对照组间差异有统计学意义(P=0.048)。对照组H4单体型频率显著高于sAD组，差异有统计学意义(P=0.024)；按ApoEε4分层后，在非ApoEε4携带者中，该差异仍有统计学意义(P=0.023)。对照组基于H4的双体型频率显著高于sAD组，差异有统计学意义(P=0.029)；按ApoEε4分层后，在非ApoEε4携带者中，该差异仍有统计学意义(P=0.040)。结论：BDNF C270T 位点的SNP可能与sAD的易感性相关，H4单体型及其构成的双体型是sAD的遗传保护因素，对非ApoEε4携带者而言尤其如此。 【关键词】 阿尔茨海默病； 脑源性神经营养因子； 载脂蛋白E； 单体型； 双体型 阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)病因目前仍未明确，遗传因素是其发病的重要危险因素［1］。研究表明，载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）ε4等位基因是散发性AD（sporadic AD，sAD）的危险因素［2］，但并非ε4等位基因携带者均发展为AD，提示可能存在其他遗传危险因素。 尸检发现，AD患者海马脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF) mRNA下降［3］。胎鼠细胞模型研究发现，BDNF基因G196A单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）可影响该基因的蛋白表达（缬氨酸替代蛋氨酸）［4］；有研究发现BDNF基因G196A、C270T与AD发病有关［5-6］，但目前仍存在争议。本研究对sAD患者BDNF基因G196A和C270T多态性及其与ApoE的相互作用进行分析。 1 对象与方法 1.1 对象 sAD组患者105例，来自东南大学附属中大医院、南京医科大学附属脑科医院和江苏省扬州五台山医院，男48例，女57例，平均年龄（72.89±6.17）岁。痴呆的诊断标准采用美国精神病学会的精神障碍诊断和统计手册第4修订版（DSM-Ⅳ）标准。首先应用简易智能状态量表(MMSE)、日常生活活动能力量表(ADL)、画钟试验、临床痴呆量表（CDR）初筛有痴呆，然后根据文化程度对可疑痴呆患者进行详细的神经心理学检查，Hachinski缺血指数分＜4分，Hamilton抑郁量表排除抑郁症，全部进行头部影像学检查（CT或MRI），符合美国神经病学、语言障碍及卒中-AD和相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)很可能AD诊断标准，无阳性家族史。正常对照组105例，男47例，女58例，平均年龄（72.77±5.79）岁，无痴呆家族史，均为健康体检者。受试者均为汉族人，彼此无血缘关系，本人或其监护人知情同意，并获得东南大学附属中大医院伦理委员会的批准。 1.2 方法 1.2.1 模板DNA提取 取-80 ℃冰箱保存抗凝全血，采用KI法提取白细胞基因组DNA［7］，溶于TE缓冲液，-20 ℃保存。 1.2.2 引物合成 引物参照文献［5- 6,8］由上海英俊生物技术有限公司合成。 1.2.3 PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳及限制性酶切PCR扩增产物 采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，参照文献［5- 6,8］对BDNF G196A、C270T和ApoE基因多态性进行分析，见表1。表1 BDNF G196A、C270T和ApoE的引物序列、酶切及电泳条件 1.3 统计学处理 计算各组基因型和等位基因频率，检验其是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。基因多态性位点基因型频率和等位基因频率比较用χ2检验。采用SHEsis软件［9］进行连锁不平衡及单体型分析。在单体型分析基础上，双体型分析依据两个双体型组执行，采用SPSS 13.0统计软件对每个双体型进行Fisher精确检验。所有统计检验均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 Hardy-Weinberg平衡法则的吻合度检验 sA