核因子κB在胰腺癌中表达及及VEGF及p53表达相关性.docVIP

核因子κB在胰腺癌中表达及及VEGF及p53表达相关性 　【摘要】 目的 探讨核因子κB (NFκB,p65)在胰腺癌组织中的表达及其与VEGF、p53蛋白表达的相互关系。方法 电泳迁移率变动分析 (EMSA)测定45例胰腺癌及癌旁组织、8例慢性胰腺炎和9例正常胰腺组织中NFκB的活性,Western印迹法检测NFκB、IκB a蛋白表达; 免疫组织化学法检测胰腺癌中VEGF、p53、p65蛋白表达。结果 NFκB在肿瘤组织中被激活；NFκB在胰腺癌、旁组织、慢性胰腺炎、正常胰腺组织中阳性表达率分别为71.0%、20.0%、12.5%、0(Plt;0.05)；NFκB基因表达与胰腺癌的分化程度、临床分期、肿瘤大小无关(Pgt;0.05)，与淋巴结转移和周围浸润有相关性(Plt;0.05)；转移癌中NFκB蛋白表达与VEGF、p53蛋白表达显著相关。结论 核因子κB基因在胰腺癌中过度表达并与VEGF、p53一起参与胰腺癌的浸润、转移过程。 【关键词】 胰腺癌 核因子κB 抑制性κBa 血管内皮生长因子 蛋白质p53 0 引 言 最近研究发现，肿瘤细胞浸润转移能力的改变是通过核因子κB对其他因子的调节作用实现的，但具体的作用机制还不清楚。本文拟研究核因子κB在胰腺癌组织中的表达与胰腺癌生物行为的关系以及核因子κB表达与VEGF、p53表达的相关性，为肿瘤的基因治疗提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料 收集苏州大学第一附属医院普通外科2000年4月～2005年5月期间病理诊断均为导管腺癌的45例胰腺癌石蜡标本（临床资料完整）及其45例癌旁组织 (距癌灶边缘1.5～2.0cm， 33例呈Ⅰ/Ⅱ级不典型增生表现，4例呈原位癌改变，5例有炎性变化，3例有癌细胞浸润)。其中男25例，女20例，年龄36～70岁，中位数55岁；肿瘤直径＜4cm者21例，≥4cm者24例；高分化13例,中分化14例,低分化18例；根据TNM分期（1997 恶性肿瘤国际临床病期分类）标准：Ⅰ期11例、Ⅱ期9例、Ⅲ期13例、Ⅳ期12例；伴有区域或远处淋巴结转移和周围浸润者30例，其中远处转移者18例（肝转移、腹膜和网膜种植等）无淋巴结转移和周围浸润者15例。8例慢性胰腺炎和9例正常胰腺组织新鲜标本，取自壶腹癌和胰腺内分泌肿瘤的病人。所有标本在术后立即放入-70℃冰箱备用，所有病人均为第一次手术,术前未经任何放化疗。 1.2 主要试剂 鼠抗人p65单抗、鼠抗人IκBa多抗、鼠抗人p53单抗（突变型）、鼠抗人VEGF单抗，免疫组化染色（SP）试剂盒均购自北京中山生物技术公司， γ32ATP标记的双链寡核苷酸探针： 5、AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC3 3、TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG5 1.3 方法 1.3.1 Westernblot分析 提取细胞核蛋白 [1]，采用Lowry法准确测定浓度。蛋白质样品上样量每泳道为100μg，用10%聚丙烯酰胺凝胶分离，并转到Hybond硝酸纤维素膜上（美国Bio Rad公司）。 1.3.2 电泳迁移率变动分析 细胞核的制备、核提取液蛋白含量的测定和反应条件参考文献[1]。 1.3.3 免疫组化 操作方法按照试剂盒进行， p53、VEGF、p65表达的判断按照文献方法［2,3］。 1.3.4 统计学方法 采用医学统计软件SPSS10.0,χ2检验, Spearman相关分析。 2 结果 2.1 Western 检测NFκB、IκBa的表达 p65在肿瘤组织的灰度值高于癌旁组织，IκBa在肿瘤组织的灰度值低于癌旁组织，（正常胰腺和慢性胰腺炎组织偶见表达），说明肿瘤组织中p65激活，而IκBa失活见图1、表1。 1：肿瘤组织；2：肿瘤旁组织；3：正常胰腺组织；4：慢性胰腺炎组织 　 图1 Western印迹分析p65、IκBa的表达 2.2 EMSA检测NFκB的活性 胰腺癌组织中可见明显的条带,癌旁组织少量条带，慢性胰腺炎和正常胰腺组织未见条带，提示肿瘤组织NFκB结合活性提高，见图2。 2.3 免疫组化法检测VEGF、p53、p65蛋白表达 p65在肿瘤组织的检出率71%(32/45),高于癌旁组织20%(9/45），Plt;0.01；p53、VEGF 在胰腺癌组织中的阳性表达分别为57.8%（26/45）、64.4%（29/45），分别高于癌旁组织，差异有统计学意义（Plt;0.05），VEGF阳性染色位于细胞质，阳性细胞分布在血管周围，见图3。 1：正常胰腺组织；2：慢性胰腺炎组织；3：肿瘤旁组织；4：肿瘤组织 图2 NFκB在不同组织中的活性检测 2.4 胰腺癌的临床病理特征与p65蛋白表达的关系