浅析恶性疟疾疫苗研制.docVIP

浅析恶性疟疾疫苗研制 　　建立ELISA检测方法是进行多肽-蛋白偶联物制备的质控方法，以下是小编搜集整理的一篇探究恶性疟疾疫苗研制的论文范文，欢迎阅读查看。 　　疟疾是以疟原虫为病原体并通过按蚊叮咬传播的寄生虫病，是世界上分布和流行最广的寄生虫性疾病之一，世界上约有20亿人口生活在疫区[1].在我国，疟疾也是一种严重危害人类生命健康的疾病。 　　2010年我国政府公布了《中国消除疟疾行动计划(2010~2020年)》，提出在2020年全国实现消除疟疾的目标[2].因此，对中国以及全球来说，迫切需要研制预防疟疾的疫苗。 　　疟原虫生活史复杂，包括有性、无性两个阶段三个时期。由于疟原虫抗原在各个时期不同，抗原性较弱且有多个抗原表位，加之疟原虫的致病机理尚不十分清楚，这些因素给疟疾疫苗的研究带来了极大的困难。 　　根据疟原虫在人体的生活史，可将疟疾疫苗分为3种，即抗红前期原虫疫苗、抗红内期原虫疫苗和传播阻断疫苗。位于子孢子表面的环子孢子蛋白(circumsporozoiteprotein,CSP)是抗红前期原虫疫苗的重要候选抗原。Dame等[3]研究发现，在CSP蛋白中存在重复37次的Asn-Ala-Asn-Pro(NANP)四肽重复序列(NANPrepeatedmotif)，该序列重复4次，而且这种重复无株间差异。Gerloni等[4-5]构建了包含3个重复的NANP四肽重复序列的IgG重链基因的重组质粒，并用该质粒免疫小鼠后，在持续2年的时间内观察到机体产生了特异的抗NANP反应。 　　Kubler-Kielb等[6]通过蛋白质水平的偶联技术，实现了将4或5个重复的NANP四肽重复序列与pfs25蛋白质自身聚体的物理连接，并将此复合物免疫小鼠，结果显示，小鼠体内可产生特异性的抗pfs25蛋白及抗CSP应答。 　　基于CSP蛋白结构，美国葛兰素史克生物公司(GSK)研发了RTS,S/AS01恶性疟疾疫苗，2011年的初步研究结果显示，在为期12个月的观察期内，6000名5~17月龄幼儿注射3剂疫苗后，患疟疾和恶性疟疾的风险分别降低了56%和47%[7].这是恶性疟疾疫苗至今获得的最好的实验数据。 　　NANP四肽重复序列仅是CSP蛋白质的一个结构区域，若开发针对该四肽重复序列的单克隆抗体，则可提供检测该序列的特异性和敏感性，有益于基于NANP四肽重复序列的各项基础及应用研究。因此，本实验以BSA(-NANP)5偶联蛋白为免疫原，利用经典杂交瘤技术，筛选出10株杂交瘤细胞株，为进一步的研究工作奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1多肽及细胞(NANP)5多肽、(NANP)5C多肽均由本公司委托北京赛百盛生物公司合成，经HPLC纯化后纯度为95%,各合成50mg;SP2/0骨髓瘤细胞由本公司第四研究室保存。 　　1.2实验动物SPF级BALB/c鼠，雌性，6~8周龄，体重12~14g,动物合格证号为：SYXK(甘2012-0002);清洁级F1鼠，雌性，体重16g以上，动物合格证号为：SYXK(甘2012-0003)，均由本公司动物实验室提供。 　　1.3主要试剂RPMI1640、胎牛血清、黄嘌呤(hy-poxantin,HAT)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)培养基购自美国GIBCO公司;HRP、过碘酸钠(NaIO4)、HRP标记的兔抗鼠IgG、免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒、己二酸二酰肼(adipicdihydrazide,ADH)、BSA、乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺[1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)CarbodiimideHydrochloride,EDC]购自美国Sigma公司;ImjectMa-leimideActivatedBSAKit购自美国ThermoScienti-fic公司;弗氏佐剂由本公司第四研究室制备;2(-N-吗啉代)乙磺酸[2(-N-Morpholino)ethanesulfonicacidhydrat,MES]、硫氰酸氨、秋水仙素、考马斯亮蓝R-250等为国产试剂。 　　1.4抗原板条(NANP)5及(NANP)5C多肽、戊型肝炎病毒(HEV)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、睫状神经生长因子(ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)等抗原板条由本公司第四研究室制备并保存;CSP蛋白为中国食品药品检定研究院细菌一室惠赠[8],并由本公司第四研究室制备抗原板条。 　　1.5完全抗原的制备选择BSA作为载体蛋白，应用以下2种方法将(NANP)5或(NANP)5C多肽与载体蛋白偶联。方法1[马来酰亚胺修饰的BSA与(NANP)5C偶联法：马来酰亚胺修饰的BSA与(NANP)5C偶联，具体操作按ImjectMal