淡豆豉防治早期动脉粥样硬化大鼠血管损伤机制探究.docVIP

淡豆豉防治早期动脉粥样硬化大鼠血管损伤机制探究 　 作者：白霞 牛丽颖 刘娇 李清 崔力剑 窦玉红 曹秀莲 【摘要】 　　目的研究淡豆豉防治早期动脉粥样硬化大鼠血管损伤的机制。方法采用高脂饲料喂养法建立大鼠早期动脉粥样硬化模型，同时灌胃给予淡豆豉提取物，连续10周，末次给药后取血、分离血清全自动生化分析仪检测TC，TG，LDL，HDL水平，透射电镜下观察主动脉损伤的形态学变化，流式细胞仪检测主动脉内皮细胞的凋亡率、Caspase-3的蛋白表达和增殖指数。结果淡豆豉组（20，40 g生药/kg）大鼠血清TC，TG，LDL水平均较模型对照组大鼠降低（Plt;0.01），主动脉内皮细胞的形态明显较模型对照组改善，内皮细胞的凋亡率、Caspase-3的蛋白表达均显著降低（Plt;0.01），而增殖指数显著增高(Plt;0.01)。结论淡豆豉对早期动脉粥样硬化大鼠血管损伤有明显的保护作用，其机制可能通过下调Caspase-3的蛋白表达，调节血管内皮细胞凋亡与增殖的平衡来实现。 【关键词】 淡豆豉 早期动脉粥样硬化 血管损伤 Caspase-3蛋白 　　淡豆豉Semen Sojae Preparatum (SSP)是由豆科植物大豆Glycine max（L.）Merr.的成熟种子和青蒿、桑叶等中药经发酵加工而成，其中的主要成分大豆异黄酮具有广泛的生物学活性，研究资料显示大豆异黄酮的植物雌激素作用，可以降低人体多种雌激素依赖型疾病的发病率。据此思路,我们早期的研究发现淡豆豉对去卵巢大鼠脂代谢紊乱有明显的调整作用，对心血管系统具有保护作用［1～3］。本实验采用高脂饲料喂养法建立大鼠早期动脉粥样硬化模型，造成血管内皮细胞损伤，探讨淡豆豉对血管内皮损伤的保护作用及其作用机制。 　　1.1 药物与试剂 淡豆豉，均购自石家庄市乐仁堂药店，实验前淡豆豉提取物80%乙醇提取两次，2 h/次，减压浓缩至4 g生药/ml备用。吉非罗齐，保定市古城药厂，批号040625，实验前用CMC溶解，配制浓度为0.016 g/ml溶液备用；TC，TG，LDL，HDL试剂盒，日本协和株式会社提供。 　　1.2 动物SD大鼠（二级），体重180～200 g，雄性，由河北省实验动物中心提供，许可证号为SCXK（冀）2003－1－003，动物饲料亦由该中心提供。 　　1.3 仪器全自动生化分析仪（瑞士）；透射式电子显微镜（日立H-7500型）；Epics-XLⅡ型流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司。 　　1.4 方法 　　1.4.1 动物模型 采用高脂饲料喂养10周造成大鼠高脂血症模型（高脂饲料配方：2%胆固醇，0.5%胆酸钠，10%猪油，0.02%他巴唑，普通饲料87.48%）。 　　1.4.2 分组与给药 将大鼠随机分为5组。分别为正常对照组、模型对照组、淡豆豉提取物低剂量组（20 g生药/kg）、淡豆豉提取物高剂量组（40 g生药/kg）及阳性药吉非罗齐对照组(0.16 g/kg)。自造模开始，淡豆豉高剂组每日灌胃给予4 g生药/ml的淡豆豉提取物，淡豆豉低剂组每日灌胃给予2 g生药/ml的淡豆豉提取物，阳性对照组每日灌胃给予0.016 g/ml吉非罗齐混悬液，模型对照组和正常对照组给予等容量的自来水。 　　1.5 检测方法 　　1.5.1 血清脂质及脂蛋白测定给药10周后，各组大鼠禁食12 h，分别用乙醚麻醉，眶后静脉取血，分离血清，全自动生化分析仪测定TC，TG，LDL，HDL水平。 　　1.5.2 流式样品制备与检测各组随机取6只大鼠，剖取胸主动脉约2 cm长，剥取内膜，70%乙醇固定，制备单细胞悬液，碘化丙啶染色，同时设阴性对照，以替代一抗，阳性对照只加一抗或只加二抗，流式细胞仪检测血管内皮细胞的凋亡及Caspase-3的蛋白表达，数据采集为对数(log)方式，应用Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析。计数10000个细胞，计算凋亡率（AP）。 　　AP（%）=凋亡细胞数细胞总数×100% 　　用Muticycle AV分析软件对DNA细胞周期拟合分析，计算出DNA组方图各时相分布的百分比，以增殖指数(PI)表示细胞的增殖活性。公式： 　　PI（%）=S+G2/MG0/G1+S+G2M×100% 　　1.5.3 主动脉形态学检查方法各组剩余4只大鼠用4%多聚甲醛灌注固定后，自主动脉弓处剪取等长的动脉条，沿腹侧剖开，内膜面向上，平铺冰盘上取材，置10%甲醛固定，石蜡切片，HE染色，光镜显微镜下观察动脉病理组织学改变；另取2 mm×3 mm主动脉标本，用2.5%戊二醛2 ml固定，透射电镜观察内膜面形态特点。 　　1.6 统计学处理所得数据用SPSS软件包（Version 11.5）采用方差齐性检验及t检验。 　　　2 结果