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生长及凋亡作用实验探究 　作者：肖柳英，洪暉菁，潘竞锵，吕俊华，沈文娟 【摘要】 　　目的利用血清药理学的方法，观察荔枝核含药血清体外的抑制肿瘤细胞生长；并研究荔枝核对小鼠S180，EAC体内、外细胞生长及凋亡作用。方法小鼠 S180，EAC细胞混悬液用生理盐水按1:1进行稀释制成含瘤腹水混悬液,在给药前24 h,每只小鼠腋窝皮下接种0.2 ml。荔枝核水提液对小鼠S180，EAC抑瘤实验连续给药10 d。测定肿瘤作用与细胞凋亡表达。结果荔枝核提取物30%含药血清高中剂量和20%含药血清高剂量对HepG2肿瘤细胞具有明显的抑瘤作用， Hochest染色肿瘤细胞出现凋亡形态；而流式细胞仪检测可见30%含药血清高中低剂量的促肿瘤凋亡率分别是63.3%，45.5%和23.8%，明显高于正常血清组。荔枝核水提物能够明显抑制S180，EAC肿瘤的生长（Plt;0.05），荔枝核提取物对荷S180小鼠高剂量组的抑瘤率达到32.81%。对荷EAC实体瘤小鼠的肿瘤其抑瘤率达到30.62%；结论荔枝核具有抑制小鼠S180，EAC体内、外细胞生长的影响，促进肿瘤细胞的凋亡，从而表现抗肿瘤的作用。 【关键词】 荔枝核 小鼠 S180 EAC 抑瘤作用 凋亡 　　荔枝核为无患子科植物荔枝Litchi chinensis Sonn的干燥成熟种子。夏季采摘成熟果实，除去果皮及肉质假种皮，洗净，晒干［1］。荔枝及荔枝核的经济和药用价值逐渐受到关注,近几年来已有多篇报道用荔枝核中药治疗糖尿病的经验［2］，荔枝核具有调血脂、保肝以及抗氧化等作用［3，4］，特别是荔枝核的多糖成分在抗肿瘤、提高机体免疫活性方面具有较大的关注。基于以上的研究，本实验进一步研究荔枝核对荷瘤小鼠体内、外细胞生长及诱导细胞凋亡的影响报道如下。 　　1 材料 　　1.1 动物清洁级 ，新西兰雄性大白兔,购自广东省医学实验动物中心，实验动物质量合格证号：粤监证字2006A001。SPF级小鼠 ，购自广东省医学实验动物中心，实验动物质量合格证号: 粤监证字2006A018。 　　1.2 仪器CO2恒温培养箱（Thermo fora美国）；AIR TECH型医用超净台（苏净集团安泰公司）；XSZ-D型倒置生物显微镜(重庆光学仪器厂)；荧光显微镜（Olympus Japan）；BIO-RAD-450型酶标定量测试仪（美国）；流式细胞仪（FACSCalibur型Becton Dickinson）；BIO-RAD 电泳仪（美国）；Eppendorf 低温高速冷冻离心机（德国）。 　　1.3 试药荔枝核提取物：颗粒（颗粒∶生药＝1∶10），广东一方制药业有限公司；批号（0604229）。 环磷酰胺（CTX）：江苏恒瑞医药股份有限公司，批号 　　RPIM 1640培养液（GIBCO公司产品），批号1285082；青霉素、链霉素（广州白云山天心制药股份有限公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司产品），批号060704；胰蛋白酶（DIFICO公司生产）；四甲基偶氮唑盐（MTT，SIGMA公司产品）；二甲基亚砜（DMSO；美国Amresco公司产品）；Hochest33258(碧云天生物技术公司)；PI染料 sigma；细胞裂解液(碧云天生物技术公司)； BAX抗体（cell signaling）； BCL-2抗体（santa cruz）；GAPDH抗体（Chemicon）；ECL发光液；pierce 批号：HI106361 ；丙烯酰胺 sigma ; 甲叉丙烯酰胺 sigma ；SDS-十二烷基磺酸钠sigma；甘氨酸 Biorad；TWEEN-20 sigma；TRIS-BASE sigma;TRIS sigma ;脱脂奶粉sigma ;NC膜minipore; WHATMAN滤纸 whatman。 　　2 方法 　　2.1 实验技术路线 　　2.1.1 离体细胞实验 　　2.1.2 在体动物实验 　　2.2 含药血清的制备按李仪奎等［5］方法制备含药血清：将体重约1.5 kg的健康雄性新西兰大白兔10只随机分为荔枝核颗粒剂高、中、低剂量组和环磷酰胺（阳性对照）组，另设生理盐水（空白对照）组，共5组，每组2只。荔枝核颗粒剂高、中、低剂量组给药剂量分别为168，84，42 g·kg-1·d-1，环磷酰胺组给药剂量为42.4 g·kg-1·d-1，空白对照组给予等体积生理盐水。各组动物每天灌胃给药或生理盐水，2次/d，每次间隔12 h，灌药前4h禁食不禁水，连续3 d，末次灌胃1 h后，3%戊巴比妥钠麻醉，颈动脉采血，4℃下静置4 h，3 000 r·min-1离心15 min，无菌分离血清经56℃，30 min灭活处理后，0.20 μm微孔滤膜过滤除菌，置－20℃保存备用。