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王不留行中抑制血管生成活性物质探究 　 作者：花慧 冯磊 张小平 张莲芬 金坚 【摘要】 目的分析王不留行中具有抑制血管生成的活性成分。方法 分别在体外培养人微血管内皮细胞(HMEC)和体内鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型的实验指导下，从王不留行中分离得到两种成分，用化学与光谱分析法鉴定其化学结构。结果这两种活性成分分别为王不留行环肽A，E。结论王不留行中抑制血管生成的活性成分是王不留行环肽A，E。 【关键词】 王不留行 环肽 王不留行环肽A，E 血管生成 王不留行系石竹科麦蓝菜Vaccaria segetalis(Neck) Garcke 的干燥成熟种子, 为传统常用中药,有行血通经, 催生下乳, 消肿敛疮等功效。其植物资源丰富, 除华南外, 全国各地均有分布, 尤以河北产量最大［1］，据报道其含有生物碱、黄酮、皂苷及环肽类等成分。本文在抑制HMEC增殖活性实验和鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验的指导下，对王不留行进行了系统地提取分离，最终得到两种活性较高的成分，结构鉴定为王不留行环肽A、E。首次发现王不留行中环肽A，E具有抑制血管生成的作用。　 　　1 器材 　　1.1 材料与仪器AKTA explorer 100液相系统(Amersham公司)；SRB ( Sigma公司)；MCDB-131细胞培养基(Gibco BRL 公司)；胰酶、小牛血清、L-谷氨酰胺(华美生物工程公司) ；WATERS Platform ZMD 4000型液质联用仪(Waters公司)；富立叶变换红外光谱仪；Model 3110 细胞培养箱(Thermo-Forma公司)；MK3型酶标仪( Thermo-Lab-Systems公司) ；王不留行药材购自江苏省无锡市山禾药业股份有限公司，南京中医药大学陈建伟教授鉴定为Vaccaria segetalis (Neck) Garcke。受精黄皮种蛋购自无锡马山种鸡场。 　　1.2 细胞株人微血管内皮细胞(HMEC)由法国国家卫生医药研究院U553研究所(INSERM U553) 陆核教授馈赠，保存于液氮罐中。 　　2 方法 　　2.1 样品提取与分离在体外抑制HMEC增殖活性实验指导下，按以下步骤进行分析：将5 kg王不留行水煎煮两次，提取液静置，离心，去沉淀，上清液经D-101型大孔树脂柱，依次以水，30%乙醇，50%乙醇，75%乙醇洗脱。收集75%乙醇洗脱液，回收浓缩至无乙醇味，再用正丁醇萃取，取正丁醇萃取物经反相Resource柱分离，CH3CN梯度洗脱得到组分A（16.8 mg, tR＝35 min)和组分B（24 mg, tR＝42 min)。 　　2.2 细胞培养　将HMEC用含1 mmol/L谷氨酰胺、1 mg/L氢化可的松、10 μg/L EGF和150 ml/L 小牛血清的MCDB-131培养液, 于37℃，50 ml/L CO2培养箱中传代培养。 　　2.3 SRB实验 参照Skehan等［2］报道的SRB方法测定组分A、B对HMEC增殖的抑制率。取对数生长期细胞，按每孔7 000～8 000个细胞接种于96孔板中放置于37℃，50 ml/L CO2 的培养箱中培养过夜，加入不同浓度的组分A、B ，以不加药组为阴性对照培养72 h。去上清液, 每孔轻轻加入100 g/L三氯醋酸100 μl固定, 静置5 min后移到4℃再放置1 h倒掉固定液, 用去离子水洗5次, 空气干燥。每孔加入4 g/L SRB 100 μl室温放置30 min，用10 ml/L醋酸液洗5次，加入150 μl 10 mmol/L Tris碱液(pH 10. 5)溶解，用MK3型酶标仪在波长A570处测定每孔A 值。计算抑制率(% )同时绘制药物浓度抑制率曲线, 求出半数细胞抑制浓度( IC50) 。抑制率（%）= ［(对照组的A值- 药物组的A 值) / (对照组的A值- 空白组的A值) ］ ×100%。 　　2.4 CAM血管生成实验受精黄皮种蛋，参考文献方法［3］制备鸡胚尿囊膜。用打孔器制备直径为6 mm的微孔滤膜圆片，湿热高压消毒。设组分A、B给药组和生理盐水阴性对照组。将药物滴于滤纸上，制成药膜，吹干备用。鸡胚培养3 d后分组，将药膜贴于CAM的部位。加药48 h后，观察药膜周围的血管数，并摄影记录。 　　　2.5 组分A、B的液质联用分析 　　2.5.1 液相色谱条件色谱仪：WATERS 2690；检测器：WATERS 996；分析柱：SUNFIRE C18( 2.1 mm×150 mm)；流动相：甲醇∶水，65%甲醇洗脱；柱温：35℃；流速：0.5 ml/min；进样量：5 μl。 　　2.5.2 质谱分析条件离子方式：EIS；毛细管电压：3.88 KVolts；锥孔电压：15 Volts；离子源温度：1