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白术四倍体试管苗形态学特征研讨 　　白术是菊科苍术属多年生草本植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎lt;supgt;[1]lt;/supgt;。近代药理研究发现白术具有抗肿瘤、抗衰老、免疫调节及抑制子宫平滑肌等作用lt;supgt;[2-3]lt;/supgt;。目前我国白术人工栽培品种退化、产量低下、病虫害严重、药材品质越来越差，无法满足市场需求。因此，白术新品种的选育是目前生产中亟待解决的问题。多倍体育种是所有新品种选育方法中最有可操作性的一种手段，药用植物多倍体在自然界中表现出明显优势，其抗逆性强、营养部位大、活性成分含量高，长期以来受到广大育种专家的重视lt;supgt;[4-5]lt;/supgt;。白术四倍体诱导虽有文献报道lt;supgt;[6-7]lt;/supgt;，但前人的研究诱导率低（13.3%～15%），新品种选育风险大，难以形成规模化生产。鉴于此，本文在前人研究基础上，对诱导剂的灭菌、诱导浓度及时间等进行了新的尝试，以期获得高产、优质、高抗的白术新品种。 　近年来，国内外对白术的研究主要集中在化学成分lt;supgt;[8-9]lt;/supgt;、药理作用lt;supgt;[10-11]lt;/supgt;、炮制及鉴别lt;supgt;[12-14]lt;/supgt;等方面，对白术四倍体试管苗形态、细胞及遗传学等方面的系统研究尚未报道。四倍体药用植物随着染色体的加倍，其核质比例发生变化，互作效应、基因的剂量效应等都会打破原有二倍体生理生化功能的平衡，从而使植株在形态指标、器官大小及活性成分含量等方面发生一系列变化lt;supgt;[15]lt;/supgt;。为了阐明白术二倍体染色体加倍前后的DNA变化情况及四倍体试管苗外观形态呈现巨大性的变异机制，本文在研究获得白术同源四倍体的基础上，利用多态性检出较强的AFLP（DNA 扩增片段长度多态性）分子标记技术探究白术二倍体及其同源四倍体的DNA碱基序列变化，为阐述白术四倍体遗传变异机制奠定基础，以期为进一步开展白术四倍体优势品种选育及其大面积推广提供理论依据。 　1材料 　新鲜成熟的白术种子作为建立白术无菌体系的试验材料，此种子于2013年11月2日采自南京农业大学牌楼科研基地，经南京农业大学高山林教授鉴定为菊科植物A. macrocephala的种子。 　2方法 　2.1无菌体系的建立 　挑选籽粒饱满的白术种子，洗涤剂清洗3～5次， 75%的乙醇消毒30 s，0.1%的HgCllt;subgt;2lt;/subgt;灭菌6～7 min后，无菌水冲洗3～5次，接入MS培养基，20～25 d后获得白术无菌系，幼芽作为白术同源四倍体离体诱导的材料。 　2.2白术同源四倍体植株的诱导及鉴定 　2.2.1同源四倍体白术的离体诱导具体方法参照黄和平等lt;supgt;[16]lt;/supgt;，并做适当调整。将白术无菌幼芽（0.5～1 cm）浸泡在质量浓度为0.05%，0.1%，0.2%的无菌秋水仙素溶液（抽滤灭菌）中振荡培养12，24，36，48，60，72 h后，用无菌水清洗3～5次，接入MS培养基，共设计18个处理，每处理30个幼芽，做5次重复。 　2.2.2同源四倍体白术的根尖染色体鉴定秋水仙素处理后20 d左右，白术幼芽成苗，接入1/2MS+NAA 0.5 mg·Llt;supgt;-1lt;/supgt;的培养基中进行生根培养，待根长1.0～1.5 cm时切取幼嫩根尖鉴定染色体，具体方法参照向增旭等和聂杨眉等lt;supgt;[17-18]lt;/supgt;，并做适当改进。早上8：00”10：00切取叶片变异明显的白术根尖0.5～1.0 cm，置于冰水混合物中，4 ℃黑暗条件处理24 h后在卡诺固定液（乙醇-冰醋酸 3∶1）中常温处理30 min，45%的冰乙酸常温解离30 s，改良苯酚品红染色5 min，压片、镜检。将所有经过秋水仙素溶液处理后成活的植株经过3次以上根尖染色体鉴定，确定为白术同源四倍体植株后统计诱导率及死亡率。 　2.3四倍体白术的形态学分析 　2.3.1二倍体和四倍体白术的叶片差异将根尖染色体鉴定为同源四倍体的白术试管苗接入MS+6-BA 1.0 mg·Llt;supgt;-1lt;/supgt;+NAA 0.1 mg·Llt;supgt;-1lt;/supgt;的培养基中进行继代培养后对叶面积指数、叶长及叶宽等形态指标进行测量，二倍体和四倍体各测10株试管苗，每株取5片相同部位的叶片。 　2.3.2二倍体和四倍体白术的气孔差异具体方法参照汪卫星等和姚焱等lt;supgt;[19-20]lt;/supgt;，略有调整。早上8：00”9：00点，取二倍体和四倍