益肾汤对实验性IgA肾病模型小鼠肾组织转化生长因子β1表达影响.docVIP

益肾汤对实验性IgA肾病模型小鼠肾组织转化生长因子β1表达影响 　 作者：万启军，何永成，石成钢，洪国保，胡斌，栾韶东 【摘要】 【目的】观察益肾汤对实验性IgA肾病（IgAN）模型小鼠肾组织转化生长因子β1（TGFβ1）表达的影响。【方法】选用BALB/c小鼠，采用口服牛血清白蛋白联合尾静脉注射葡萄球菌肠毒素B方法复制小鼠IgAN模型，抽样检测造模小鼠24h尿蛋白定量、肾组织过碘酸雪夫反应（PAS）染色及免疫荧光检查，确定造模成功后随机分为模型组，益肾汤高、低剂量组（剂量分别为01、005g·kg-1·d-1），并设正常对照组；采用荧光定量聚合酶链反应（FQPCR）法检测各组小鼠肾组织TGFβ1mRNA表达，免疫组化法检测各组肾组织TGFβ1含量。【结果】模型组肾组织TGFβ1mRNA表达及TGFβ1含量均显著升高（Ｐ＜００５）；益肾汤高、低剂量组肾组织TGFβ1mRNA表达及TGFβ1含量均显著降低（Ｐ＜００５）。【结论】益肾汤治疗IgAN的作用与抑制肾组织中TGFβ1的分泌及其mRNA表达有关。 【关键词】 益肾汤/药理学；IgA肾病/中药疗法；肾/病理学；转化生长因子β；疾病模型，动物；小鼠 研究证实细胞因子在IgA肾病（IgAN）的发生发展过程中起重要作用，其中，转化生长因子β1（TGFβ1）是公认的最重要的致纤维化因子［1］。本研究观察了TGFβ1在实验性IgAN小鼠肾组织中表达的特点及中药方剂益肾汤对TGFβ1的影响，现报道如下。 　　1材料与方法 11益肾汤组方及制备益肾汤组成：黄芪15g、生地20g、牡丹皮10g、熟地15g、赤芍10g、当归10g、山药15g、茯苓15g、山茱萸15g、金樱子15g、枸杞子15g、白茅根30g、女贞子15g、旱莲草15g、仙鹤草20g。按照“人—鼠用药剂量转换公式”计算，浓缩成高浓度（相当于成人剂量的2倍）及低浓度（相当于成人的每日用量）2种剂型，原液装瓶，高压消毒后密封保存，备用。 12实验动物BALB/c小鼠60只，鼠龄8～10周，体质量18～22g，雌性。由中山大学实验动物中心提供，动物许可证：SCXK(粤)20040011，动物批号：NO0018045，粤监证字：2006A003。 13主要试剂与仪器牛血清白蛋白（BSA）由深圳晶美生物有限公司提供，批号：RF101010；POINT GV20 (BAIHUI);POINT SP6 (SANYINJIAO)葡萄球菌肠毒素B（SEB）由中国军事医学科学院微生物流行病研究所提供；Trizol试剂（Invitrogen公司）；Primer express 20 软件（美国Applied Biosystem Inc.）；PE 9600型PCR仪（美国Perkin Elmer公司）；逆转录聚合酶链反应（RTPCR）试剂盒（德国QIAGEN 公司）；脱氧核糖核苷酸（dNTPs）（10mmol/L，华美公司）；PE 7000型荧光定量仪（美国Perkin Elmer公司）；PCR buffer（美国ABI公司）；dNTPs （25mmol/L,Sigma公司） ；荧光探针（10pmol/μL，上海生工）；Taq 酶（美国ABI公司）；德国KONTRON IBAS 25全自动图像分析系统。 14造模与分组按文献［2］方法复制小鼠IgAN模型：隔日灌服200mg/kgBSA，6周后按20mg/kg每日1次定期尾静脉注射BSA连续3d。8周时按05mg/kg尾静脉注射SEB，每周1次，连续3周，观察至12周末。造模第5周末，抽样检测造模小鼠24h尿蛋白定量、肾组织过碘酸雪夫反应（PAS）染色及免疫荧光检查，并与正常小鼠对照，确定IgAN模型成功后，随机分为模型组，益肾汤高、低剂量组，并设正常对照组；益肾汤高、低剂量分别以01、005g·kg-1·d-1剂量灌胃给药，模型组、正常对照组灌服等容积蒸馏水，每日1次，均连续7周。 15荧光定量聚合酶链反应法（FQPCR）检测各组小鼠肾组织TGFβ1mRNA的表达 151肾组织RNA的提取取肾组织块（约100mg）置匀浆器，加Trizol1mL，冷冻匀浆，转置于15mLEppendorf 管，加入氯仿02mL，盖紧盖子，用力摇动15s，15℃～30℃孵育2～3min，4℃、12 000r/min离心15min；取上清液至另一个15mLEppendorf管，加与上清液等容积的异丙醇，15℃～30℃孵育样品10min，4℃、12 000r/min离心10min；弃上清液，体积分数75%乙醇洗涤沉淀1次，4℃、7 500r/min离心5min；弃乙醇，空气或真空干燥5～10min（不要完全干燥），加焦碳酸二乙酯水（