糖基化终产物对人肾小球系膜细胞结缔组织生长因子及纤维连接蛋白.docVIP

糖基化终产物对人肾小球系膜细胞结缔组织生长因子及纤维连接蛋白 　【摘要】 目的：探讨体外培养条件下糖基化终产物（AGEs）对人肾小球系膜细胞结缔组织生长因子 (CTGF)及纤维连接蛋白（FN）基因表达的影响。方法：用不同浓度体外制备的AGEs干预系膜细胞及同一浓度的AGEs干预细胞不同时间。应用RTPCR检测细胞中CTGF和FN的mRNA水平。结果：随着AGEs干预浓度的增加或干预时间的延长，系膜细胞CTGF和FN mRNA水平与对照组相比显著上升。结论：AGEs可导致人肾小球系膜细胞CTGF和FN mRNA的表达增加，在糖尿病肾病的发生、发展中起一定作用。 【关键词】 糖基化终产物；肾小球系膜细胞；糖尿病肾病；结缔组织生长因子；纤维连接蛋白 糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的慢性微血管并发症之一，其特征性病理变化是肾小球系膜区扩大、毛细血管基膜增厚、细胞外基质大量积聚而最终导致肾小球硬化。大量研究表明糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）在DN的发生发展过程中起了重要作用[1]，其可通过诱导各种生长因子的过表达而加速肾脏纤维化。本研究拟通过研究体外制备的AGEs对人肾小球系膜细胞结缔组织生长因子（CTGF）、纤维连接蛋白（FN）表达的影响，探讨AGEs在肾小球纤维化中的作用。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA，AMRESCO产品)，D葡萄糖(分析纯，重庆北培化学试剂厂产品)，人肾小球系膜细胞（human renal mesangial cell,HRMC，阮雄中博士惠赠），DMEM、HEPES（ GIBCO公司），小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），TRIZOL、RTPCR试剂盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis）、DNA Marker SM0241、Taq酶均购自 Fermentas公司，CTGF、FN及βactin引物（上海申能博彩生物工程公司）,琼脂糖（MDBio公司）。引物序列及扩增片断分别为：βactin,上游5′CCCTG GACTTCGAGCAAGAGAT3′，下游5′GTTTTCTGCGCA AGTTAGG3′，531bp；CTGF,上游5′AAATCTCCAAGC CTATCAAG3′,下游5′TTCATGCCATGTCTCCGTACA3′，270bp；FN,上游5′TAGCCCTGTCCAGGAGTTCA3′,下游5′CTGCAAGCCTTCAATAGTCA3′，346bp。 　　1.2 方法 1.2.1 AGEBSA的制备 将葡萄糖用0.02mol·L -1 PBS溶液(pH7.4)配成0.5mol·L-1溶液，加入BSA (浓度为5.0g·L-1)，过滤除菌，37℃孵育3 个月。用PBS 溶液透析除去未结合的葡萄糖。对照组BSA 除不加葡萄糖外，同上条件制备。荧光光谱扫描鉴定。 1.2.2 细胞培养及分组 细胞培养在DMEM培养液(含10mmol·L-1 Hepes、0.37% NaHCO3、100U·L-1青霉素、100U·L-1链霉素及10%灭活小牛血清)中，置于37℃、体积分数为0.05的CO2中饱和湿度下培养，将处于对数生长期的细胞按1×104 移入六孔板中孵育至细胞次全融合。分别用浓度为50、100、200及400mg·L-1 的AGEBSA 和BSA 干预24h，然后选取敏感浓度200mg·L-1的AGEBSA 和BSA 分别干预0、24、48和72h，并以无血清培养基(DMEM)作为空白对照。 1.2.3 RTPCR检测CTGF、FN mRNA的表达 各组至培养终点后以Trizol法提取细胞总RNA，经紫外分光光度计测定RNA的A260 nm与A280 nm的比值在160～1.80之间，1%的甲醛变性凝胶电泳证实所提RNA的完整性较好(有28s与18s两条电泳带,其光密度比值等于2.0)。以2μg总 RNA为模板逆转录合成 cDNA，用特异性引物对逆转录产物进行半定量PCR。以βactin作为内参引物,在同一体系中进行CTGF、FN mRNA和βactin共同扩增。扩增条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共27个循环；最后72℃延长7min。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用GelDocIt imaging system扫描分析仪扫描凝胶图谱，使用Smartview分析软件对RNA条带进行密度扫描分析，得出目的条带与内参照条带的吸光度比值。至少重复3次独立的RTPCR全过程。