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纳米肿瘤疫苗制备工艺优化及特性鉴定 　【摘要】 目的: 制备无明显毒性、 高效的恶性肿瘤基因工程纳米疫苗。方法: 纯化融合蛋白MH, 薄膜分散－超声法制备包裹MH的纳米脂质体肿瘤疫苗NL（MH）, 并评价其粒径、 包裹率及稳定性; 观察NL（MH）免疫组小鼠的急性毒性反应, 及重要脏器的病理学改变。结果: 成功制备出粒径为（80±250） nm的纳米脂质体, 其药物包裹率为30%, 于4℃放置6个月后或3 000 r/min 10 min离心后无分层, 证明其稳定性良好; 与PBS对照组相比, 免疫组小鼠未见明显毒性反应。结论: 该恶性肿瘤基因工程纳米疫苗具有良好的理化性质, 未见毒性反应。 【关键词】 肿瘤特异性抗原 脂质体 树突状细胞 肿瘤疫苗 　　肿瘤疫苗能诱导特异性的抗肿瘤免疫反应, 在肿瘤防治上已经显示出一定的效果, 被认为是最具前景的肿瘤治疗方法。本实验室运用MAGE3/Hsp70的融合蛋白免疫小鼠, 结果显示融合蛋白诱导机体产生高效的MAGE3特异性CTL, 对表达MAGE3的B16细胞有很好的杀伤效果［1］ 。为了使该融合蛋白能更好地被机体摄取且更好地靶向肿瘤组织, 更有效地激活机体产生针对MAGE3的特异性CTL, 对表达MAGE3的肿瘤细胞具有更强的杀伤作用, 本部分实验中采用纳米脂质体为载体, 包裹MAGE3/Hsp70的融合蛋白（MH）制备恶性肿瘤基因工程纳米疫苗。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　分光光度计（UV3000型）为日本岛津公司产品; 透射电子显微镜（JEM2000 EX型）为日立公司产品; 集热式恒温加热磁力搅拌器（DF101B型）为巩义市予华仪器有限责任公司产品; 20 kHz/500 watt超声粉碎仪为美国ColeParmer公司产品; RPMIl640培养基购自 美国Gibco公司; 蛋黄卵磷脂和胆固醇为德国Merck公司产品; 其他试剂均为进口超纯级或国产分析纯级; pET28α（+）MAGE3/Hsp70质粒由本实验室研制。 　　1.2 方法 　　1.2.1 MAGE3/Hsp70融合蛋白的纯化与鉴定 　　MAGE3/Hsp70融合蛋白的纯化见文献［1］。采用Western blot法对MAGE3/Hsp70融合蛋白进行鉴定, 即取10 μg MAGE3/Hsp70的融合蛋白, 采用20 μL 20 mol/L PBS重悬细胞, 加入20 μL 2×Loading Buffer, 进行SDSPAGE。采用80 V, 60 min转移PVDF膜, 50 g/L脱脂乳TTBS室温下封闭PVDF膜60 min, 用TTBS 1∶500稀释MAGE3抗血清, 从封闭液中取出膜, 放入抗血 清中, 37℃ 60 min。TTBS洗膜3次每次10 min, 采用TTBS缓冲液1∶5 000稀释HRP标记的生物素化二抗, 37℃ 60 min, TTBS洗膜, DAB显色。 　　1.2.2 纳米脂质体的制备及工艺优化 　　采用薄膜分散超声法制备纳米疫苗, 选用4因素、 3水平正交设计进行工艺优化见表1（4个因素分别为大豆卵磷脂和胆固醇摩尔比（A）、 脂和水体积比（B）、 超声时间（C）、 PBS的pH值（D）, 以包封率为考察指标来筛选处方）。脂质体具体制备步骤如下：秤取处方量的大豆卵磷脂和胆固醇于100 mL烧瓶中, 加入氯仿1～2 mL, 置于65～70℃ 水浴中, 于旋转蒸发仪上旋转, 减压除去氯仿, 得到磷脂膜。另取溶有目的蛋白（1 g/L）的PBS（ pH=7.5±0.5）20 mL 于小烧杯中, 同置于65～70℃ 水浴中, 保温待用。取预热的PBS, 加至含有磷脂膜的烧瓶中, 65～70℃水浴中搅拌水化10～20 min, 即成脂质体液。取出该液于烧杯中, 置于磁力搅拌器上, 室温下搅拌30～60 min。冰水浴条件下超声10～20 min, 即得脂质体胶体液。0.1 μm聚碳酸树脂纤维过滤3次, 整粒, 得粒径较均匀的脂质体。用0.22 μm的滤膜过滤除菌后, 于4℃保存。表1 各个因素不同配比的正交设计（略） 　　1.2.3 NL（MH）的性质鉴定 　　(1)形态观察: 将制成的NL（MH）500倍稀释于生理盐水中, 取100 μL滴于400目铜网上, 1 min后吸去上清, 10 g/L磷钨酸负染色1 min, 自然晾干后在透射电子显微镜下观察其形态。将采集的图象经计算机图象分析, 求得NL（MH）的平均粒径。(2)包裹率及稳定性测定: 采用SephedexG100凝胶层析法, 洗脱液为PBS, 流速为0.5 mL/min。取NL（MH）1.0 mL上柱, 收集游离峰即为游