聚乙二醇修饰胆固醇酯酶在高密度脂蛋白胆固醇均相测定中作用.docVIP

聚乙二醇修饰胆固醇酯酶在高密度脂蛋白胆固醇均相测定中作用 　【摘要】 目的：对胆固醇酯酶进行修饰，评价修饰酶的反应选择性。方法：采用各种聚乙二醇修饰剂对胆固醇酯酶进行修饰从而获得一系列修饰酶，然后研究这些修饰酶在高密度脂蛋白胆固醇的临床检验中的作用。结果：经双臂聚乙二醇修饰剂修饰的酶比用其他修饰剂修饰的酶具有更好的热稳定性和更高的酶活性，且表现出了较高的对高密度脂蛋白胆固醇的反应选择性。结论：表面活性剂对高密度脂蛋白的选择性解离作用非常重要，这有助于修饰酶发挥其对高密度脂蛋白胆固醇的反应选择性。 【关键词】 聚乙二醇修饰酶 胆固醇酯酶 高密度脂蛋白 解离剂的选择性 众多流行病学与临床研究证实，动脉粥样硬化（AS）、冠心病（CHD）的发生率与血清高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）水平呈负相关，而与低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）水平呈正相关。快速准确地测定血清中的HDLC与LDLC水平对临床诊断意义重大[13]。高密度脂蛋白胆固醇均相测定法（HDLC homogeneous methods）通称直接法（direct method），由于样品不需预处理，可用自动分析仪检测，适合于大规模流行病学调查及工作量大的实验室使用，具有标本用量少、快速、简便、精密度高等优点[4]。Sugiuchi等[5]研制出的聚乙二醇修饰酶法（PEGME法）测定HDLC是一种重要的均相测定方法，具有线性关系好、抗干扰能力高、特异性好等优点[ 67]，现已广泛用于临床检验。该方法利用胆固醇酯酶及胆固醇氧化酶经过PEG6000修饰后而引起酶的变构，变构酶对脂蛋白的大小和（或）电荷具有选择性，其反应选择性依次为高密度脂蛋白(HDL)gt;乳糜微粒（CM）gt;极低密度脂蛋白（VLDL）gt;低密度脂蛋白（LDL）,从而达到检测HDLC的目的[5]。本研究借鉴目前流行的蛋白质聚乙二醇化学修饰技术[89]，首先合成了一系列聚乙二醇类修饰剂，然后对胆固醇酯酶进行修饰并获得各种修饰酶，研究这些修饰酶的酶学性质，评价各种不同结构的修饰酶对高、低密度脂蛋白的反应选择性。 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器 胆固醇酯酶（CHER，190 U·mg-1）购于日本Asahi kasei公司；胆固醇氧化酶（CHOD，24 U·mg-1）购于日本Toyobo公司;辣根过氧化物酶（POD，250 U·mg-1）购于华美生物工程公司;4氨基安替比林(4AA)、N(2羟基3丙磺酰基)3,5二甲基苯胺钠盐(HDAOS)、胆固醇乙酸酯、2,4,6三硝基苯磺酸钠（TNBS）、单甲氧基聚乙二醇(mPEG，相对分子质量2000、5000）、聚乙二醇(PEG，相对分子质量4000、6000、20000）均购于Sigma公司；TritonX100购于上海伯奥生物科技公司(美国进口分装)；硫酸α环糊精（αSCD）自制[10]；超速离心所得HDL及LDL纯品由南京军区总医院捐赠。 紫外可见分光光度计（Cary 100 Bio UV Spectrophotometry,Varian），红外光谱仪(TENSOR 27,Bruker)，核磁共振仪（300 MHz,Bruker），pH计（PB10,Sartorius）。 按照Leonard等[1112]所述方法合成修饰剂，用N羟基琥珀酰胺和二环己基碳二亚胺活化，合成mPEG2000NHS、PEG4000NHS、mPEG5000NHS、PEG6000NHS和PEG20000NHS单臂聚乙二醇修饰剂，修饰剂结构如图1A所示。按照文献[1314]介绍的方法合成2mPEG2000LysNHS、mPEG5000+ 2000LysNHS以及2mPEG5000LysNHS双臂聚乙二醇修饰剂，修饰剂结构如图1B所示。 1.2 胆固醇酯酶的修饰 称取一定比例的修饰剂及原酶，分别溶解在0.2 ml磷酸缓冲液（pH 9.3,0.1 mol·L-1）中。将修饰剂溶液分3次在20 min内加入原酶试剂中，每次混合均匀，随后放入4 ℃冰箱中过夜。第2天在4 ℃下透析，透析液采用Na2HPO4NaH2PO4 缓冲液（0.1 mol·L-1，pH 8.5）。CHER浓度测定采用紫外双波长法。 1.3 修饰酶修饰化度的测定 采用TNBS法[1516]测定修饰酶的修饰化度，原理是利用2，4，63硝基苯磺酸(TNBS)能与蛋白中赖氨酸残基上的氨基进行显色反应，然后用紫外可见分光光度计进行分析。 1.4 修饰酶的活力测定[17] 原理如图 2所示，CHER将胆固醇乙酸酯水解为游离胆固醇，后者被CHOD氧化成△4胆甾烯酮并产生过氧化氢,再经过氧化物酶(POD)催化,与助色剂4氨基安替比林(4AA)