实验一、超氧化物岐化酶（SOD）.ppt

实验一、超氧化物岐化酶（SOD）对逆境的响应 一、目的和要求 植物在生命过程中不断产生活性氧，但同时又形成了一个完善的清除活性氧的防御系统，即酶促系统及非酶促系统，使植物体内活性氧的产生与清除之间维持在一个动态平衡状态。当植物受到胁迫时，这种平衡将可能被破坏，随着胁迫时间的延长和胁迫程度的加重，活性氧清除系统的功能逐渐降低，活性氧积累得越来越多，最终使细胞膜发生膜质过氧化并发生自由基链式反应，形成丙二醛（MDA），使细胞膜流动性下降，膜功能受到伤害。活性氧酶促清除系统主要有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、抗坏血酸过氧化物酶（AsAPOD）等，这些酶活性的高低可在不同程度上反应植物抗性的强弱。本试验通过测定正常生长与逆境下植株超氧化物歧化酶( SOD) 、过氧化物酶(POD)活性，了解逆境下SOD和POD酶响应的机制。 二、测定方法 氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD） 【实验原理】 SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应： 由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－ ，当加入氮蓝四唑(NBT) 后，在光照条件下，及超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替 生成速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比。反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低。 三、试剂 0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)： A母液:0.2mol/LNa2HPO4溶液（mL）； B母液:0.2mol/LNaH2PO4溶液（mL）； 0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：91.5A: 8.5B，稀释 2. 14.5mM甲硫氨酸溶液：称取0.217g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 3. 3mM EDTA-Na2溶液：称取0.1117g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100ml。 4. 60μM核黄素溶液：称取0.0023g 核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。 5. 2.25mM 氮蓝四唑(NBT)溶液：称取0.055g NBT用PBS定容至3ml（直接用5 ml枪加，不用定容），避光保存。 【实验步骤】 1. 酶液提取 称取0.1g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，分三次加入1.6ml （0.6 ml、0.5 ml、0.5 ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4℃、12000g下离心20min，上清液即为SOD粗提液。 2. 酶活性测定 （1）反应混合液配制(以30个样为准)：分别取配好的Met溶液81ml，EDTA-Na2溶液3ml， NBT溶液3ml，核黄素溶液3ml，混合后充分摇匀，放入棕色瓶中，存于冰箱中备用。 （2）分别取3ml反应混合液和100μl（可视情况调整）酶液于指形管中此即反应管；同时做两支对照管，其中1支试管加3ml反应混合液和100μl PBS（不加酶液）作为最大光还原管，另1支加3ml反应混合液和100μl PBS同时用锡箔纸包好遮光用于测定时调零。 （3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照25℃下反应20min； （4）反应结束后以不照光的对照管调零，分别测定各管在560nm下的吸光度（OD560） 3. 计算结果 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活单位（U），按下式计算活性 SOD总活性＝ [( Ack-AE )×V]/（1/2Ack×W×Vt） SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量 SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（ml）；Vt为测定时的酶液用量（ml）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。 【注意事项】 1. 酶液提取须在4℃下进行，提取后立即进行测定，冰箱中放几小时活性也会下降； 2. NBT反应液配好后过滤除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分摇匀然后使用。 3. 加反应液时最好在暗光下进行； 4. 核黄素产生O2.－ ，NBT还原为篮甲潛都