pEGFPC2GATA4真核表达载体构建及在P19细胞中表达.docVIP

pEGFPC2GATA4真核表达载体构建及在P19细胞中表达 　 作者：张金平，王巍，张雷，王慧娟，赵春芳，陈炜，赵秀军 【摘要】 目的： 构建小鼠GATA4基因融合绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFPC2GATA4，并检验其在P19细胞中的瞬时表达. 方法： 以真核表达质粒pEFSAGATA4为模板，PCR扩增得到小鼠GATA4基因片段，将目的片段亚克隆到pEGFPC2载体，卡那霉素筛选阳性克隆，经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定. 将重组质粒pEGFPC2GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞，用免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GATA4在P19细胞中的表达. 结果： 酶切、测序结果表明将基因片段GATA4正确插入pEGFPC2载体，并可在P19细胞中检测到GATA4基因和GATA4EGFP融合蛋白表达. 结论： 成功构建真核表达质粒pEGFPC2GATA4，并在P19细胞瞬时表达成功，为进一步研究GATA4在心脏发育中的作用奠定了基础. 【关键词】 pEGFPC2载体；GATA4；真核表达质粒；P19细胞；转染 0引言 　　GATA4是GATA锌指转录因子家族中的一员，具有结合核酸共同序列GATA的特性，是目前研究最多的与心脏发育密切相关的转录调控因子之一［1］. GATA4作为心脏前体细胞的最早标志之一，在调节心肌细胞的发生、分化以及心肌前体细胞形成线状心管等过程中发挥重要作用［2］. 为进一步研究转录因子GATA4在心脏发育及心肌分化中的作用，本研究构建了含有小鼠GATA4编码框的pEGFPC2GATA4真核表达载体，并在P19细胞中瞬时表达成功，为进一步研究心脏特异转录因子的功能及调控机制奠定了基础. 1材料和方法 1.1材料限制性内切酶EcoRI, XbaI和HindⅢ购自TaKaRa，转染试剂Lipofectamine2000和培养基αMEM购自invitrogen公司，DNA回收试剂盒、T4 DNA连接酶、DNA marker购自宝生物公司，PCR试剂盒购自赛百盛公司，质粒抽提试剂盒购自Promega公司，pEFSAGATA4质粒由日本Hiroshi AKAZAWA博士惠赠，pEGFPC2载体、感受态菌株DH5α由本实验室保存. P19细胞系来源于中国武汉细胞库. 胎牛血清、胰蛋白酶、青链霉素、SP免疫组化即用型试剂盒、兔GATA4一抗（Santa公司）均购于博海生物公司. 1.2方法 1.2.1PCR扩增GATA4基因编码框以pEFSAGATA4质粒为模板，上游引物：5′GCCGGAATTCATGTACCAAAGCCTGGCCATGGC 3′，引入酶切位点EcoRI；下游引物：5′GCGCTCTAGATTACGCGGTGATTATGTCCCCATGA 3′，引入酶切位点XbaI. 反应体系如下：10×Buffer(含MgCl2)2.5 μL，5 mmol/L dNTP 2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，质粒模板DNA 0.5 μL，5 U/μL ExTaq酶0.2 μL，补水至25 μL，瞬时离心混匀，循环参数：95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 80 s，25个循环；72℃ 10 min. 反应完毕后，琼脂糖凝胶电泳，割胶回收靶片断，回收步骤参见宝生物溶胶回收试剂盒. 1.2.2酶切和连接将上一步回收纯化的DNA和载体pEGFPC2用XbaI和EcoRI限制性内切酶分别消化并再次回收. 酶切体系如下：Buffer M 5 μL, BSA 5 μL, 待切DNA 30 μL, XbaI 1 μL,补水至50 μL. 酶切条件：37℃，2 h,再加5 μL Buffer H，混匀后加EcoRI 2 μL进行酶切，37℃，2 h. 回收后将二者连接，连接体系： Ligation Buffer 1 μL, T4 DNA连接酶1 μL, Gata4扩增后酶切并回收产物2 μL, pEGFPC2酶切回收产物2 μL, 共10 μL，短暂离心混匀后，置16℃恒温过夜. 1.2.3转化大肠杆菌、阳性克隆菌落PCR鉴定连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含抗生素Kana的LB培养基上，培养16～24 h，挑取多个阳性菌落,进行PCR鉴定，PCR反应体系、循环参数和引物同上. 1.2.4重组质粒酶切及测序验证挑取阳性菌落，Promega质粒抽提试剂盒抽提重组质粒，经酶切鉴定，并送上海生工测序. 1.2.5P19细胞的培养和质粒转染P19细胞生长培养基配制：αMEM培养液含100 mL/L胎牛血清、青霉素1万U/L、链霉素100 mg/L，pH 7.2～7.4. 于50 mL