TALL患者外周血TCRγ-δ T细胞分布及增殖特点.docVIP

TALL患者外周血TCRγ/δ T细胞分布及增殖特点 　 作者：查显丰, 李扬秋, 陈少华, 杨力建, 李萡, 郁志 【摘要】 　　目的: 了解T细胞急性淋巴白血病（Tcell acute lymphocytic leukemia, TALL）患者外周血TCR Vγ和Vδ亚家族T细胞的分布和克隆情况。方法: 利用RTPCR扩增9例TALL患者和10例正常人外周血单个核细胞中3个TCR Vγ和8个Vδ亚家族基因的互补决定区3（CDR3）, 了解TCR亚家族Vγ和Vδ亚家族细胞的分布; 阳性产物进一步经基因扫描分析CDR3长度, 从而了解其克隆性。结果: 9例TALL患者3个Vγ亚家族的表达率都明显低于正常人Vγ亚家族的表达率（Plt;0.05）; V δ亚家族中只有Vδ1和Vδ3的表达率低于正常人（Plt;0.05）。3例TALL患者出现克隆性增殖的γ/δ T淋巴细胞。结论: TALL患者外周血TCR Vγ和部分Vδ亚家族谱系出现限制性表达和克隆性增殖。同时存在克隆性增殖γδ+ T细胞提示可能为γδ+白血病性T细胞克隆。 【关键词】 T细胞急性淋巴细胞白血病; T细胞受体Vγ基因; T细胞受体Vδ基因; 克隆性 　　T细胞受体（T cell receptor, TCR）是T细胞识别外来抗原并与之结合的特异性受体, TCR 包括有α、 β、 γ和δ四种肽链, 以两种形式存在, 它们是由二硫键连接的异二聚体包括α/β, 或γ/δ蛋白链。在前T细胞中, TCR γ和δ基因处于无功能的胚系结构状态, 在它们分化成熟的过程中发生重排形成功能性TCRγ和δ基因, 每一个TCR胚系基因包括可变区（V区）、 结合区（J区）和恒定区（C区）等基因片段, 其中TCRδ基因还包含多样区（D区）。TCRγ和δ基因它们在重排过程中形成一高度可变区VN（DN）J区（TCRγ没有D区）称为互补决定区3（complementarity determining region 3, CDR3）, 是识别抗原的区域, 由于N区插入的长短不同, 不同重排（不同克隆）的CDR3长度不同。根据这一特点, 通过检测Vγ和δ亚家族的CDR3长度, 可以了解机体T细胞不同亚家族的分布及其克隆性［1］。我们前期研究发现TALL患者存在TCR Vβ亚家族单克隆T细胞, 可能为肿瘤性克隆, 但也在部分患者中未能检测到克隆性增殖T细胞, 考虑可能存在其他类型的TALL［2］, 故本研究进一步分析TALL患者外周血单个核细胞中Vγ和Vδ亚家族的分布及其克隆性增殖等情况。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 经细胞形态学、 组织化学和细胞免疫学准确诊的TALL患者9例（编号S1～S9）, 年龄4～71岁（中位年龄21岁）, 其中男7例, 女2例。肝素抗凝收集各样本外周血, 常规方法分离单个核细胞, 10例正常人作为对照。RNAzol试剂盒购自Gibco/BRL公司; 随机引物和反转录酶试剂盒（PowerScriptTM Reverse）购自美国BD公司; Taq聚合酶分别购自Promega公司; 高质量的去离子甲酰胺(HiDiFormamide)、 GeneScan500(LIZ) Size STD Kit和POP4(Performance Optimized Polymer4)胶均购自美国PerkinElmer公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 RNA提取和cDNA合成 按常规方法用RNAzol试剂盒提取所收集的外周血单个核细胞的RNA, 并应用随机引物和反转录酶试剂盒(PowerScriptTM Reverse)反转录合成cDNA第1链, 然后以RTPCR检测β2微球蛋白基因确定合成cDNA的质量。 　　1.2.2 RTPCR扩增 　　1.2.2.1 PCR引物设计 根据4个TCRγ亚家族（其中Vγ4为假基因, 不进行检测）, 设计3个上游引物（编号Vγ1Vγ3）, 在Cγ区设计一条共同下游引物记作Cγ［3］; 根据 8个TCRδ亚家族, 设计8个上游引物（编号Vδ1～Vδ8）, 在其Cδ区上设一条共同下游引物记作C δ［4］; 并分别在下游引物Cγ和C δ的内侧设计一个荧光素标记的引物CγFam和Cδ Fam作为基因扫描和序列分析之用［4-6］, 引物由德国柏林TIB生物公司合成(表1)。 　　1.2.2.2 PCR扩增 PCR扩增按常规方法进行。总反应体系20 μL其中含1 μL cDNA产物, 任一上游引物和其对应引物(0.5 μmol/L), 0.1 mmol/L dNTP, 1.25 U Taq聚合酶, 1×PCR缓冲液, 同时设置阳性和阴性对照。反应在PCR