“泻剂结肠”大鼠胃肠道黏膜嗜铬细胞及5HT变化.docVIP

“泻剂结肠”大鼠胃肠道黏膜嗜铬细胞及5HT变化 　 作者：桂林 刘云肖 徐德龙 赵淑明 【摘要】 目的 探讨“泻剂结肠”致慢传输型便秘（STC）的发病机制。方法 采用大黄浸液灌胃建立大鼠STC模型，免疫组化法观察不同时期大鼠胃肠道黏膜嗜铬细胞的改变，荧光分光光度法检测十二指肠、乙状结肠组织匀浆及血清5HT的变化。结果 实验组大鼠半数稀便时，各段胃肠道嗜铬细胞密度明显低于对照组，80%稀便消失时，胃肠道各段肠嗜铬细胞密度增高，接近对照组；STC模型大鼠胃肠道各段嗜铬细胞密度高于对照组（胃窦、空肠、盲肠Plt;0.01，回肠Plt;0.05），十二指肠、乙状结肠组织匀浆5HT含量明显高于对照组（Plt;0.01），两组血清5HT含量无显著差异（P＞0.05）。结论 泻剂影响整个胃肠道黏膜；泻剂致STC，归因于肠嗜铬细胞对泻剂刺激逐渐耐受，5HT释放减少，胃肠道运动减慢。 【关键词】 泻剂结肠；慢传输型便秘；嗜鉻细胞 　　“泻剂结肠”是由于长期服用泻剂而致肠道神经系统失调和相应功能紊乱，使结肠动力障碍，对泻剂反应性降低，从而导致病人对泻剂形成依赖性的一种状态。其主要特点是顽固性便秘，其病因、发病机制不明。本实验采用大黄浸液建立大鼠“泻剂结肠”模型，在不同时段观察大鼠胃肠道嗜铬细胞及5HT的变化，以深入探讨“泻剂结肠”致慢性传输型便秘(STC)的病因及发病机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 药物 　　大黄粉购自乐仁堂药店，大黄粉加15倍沸水，恒温浸泡30 min后过滤制成大黄浸液。 　　1.2 动物 　　健康成年Wistar大鼠72只，雌雄各半，体重（200±20）g，河北省动物实验中心提供（合格证编号：DK0510071），随机分为实验组、对照组，每组36只，两组体重、性别无差异。 　　1.3 试剂 　　TP、5HT标准品购自Ｓigma公司；总蛋白测定试剂购自首都医科大学临床医学科技中心；兔抗5HT抗血清原液、生物素标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素购自北京中山生物技术有限公司。 　　1.4 仪器 　　970型荧光分光光度计，上海精密仪器有限公司；MDF382E型超低温保存箱，日本三洋公司；Humalyzer2000型半自动生化仪，德国豪迈公司。 　　1.5 方法 　　清洁级实验室适应性饲养1 w后，实验组用大黄浸液灌胃1次/d，首日剂量为800 mg/kg（含生粉），此后每日剂量增加200 mg/kg，直至实验组半数大鼠粪便变稀，保持剂量至80%大鼠稀便消失，继续加量给药，至半数大鼠粪便变稀，如此程序循环3次；对照组以等体积蒸馏水灌胃。待实验组第3次80%的稀便消失1 w后，大鼠禁食24 h，经口灌入100 g/L活性炭悬液2 ml，从活性炭灌胃完毕开始计时，记录从灌胃到首粒黑便排出的时间，证实实验组大鼠首粒黑便排出时间显著延长，肠道传输速度明显减慢，停止给药。建立模型时间77 d，首次出现半数致泻大黄粉用量1 600 mg/kg，最后一次调整剂量为4 600 mg/kg。 　　1.6 取材及检测指标 　　建立模型过程中，分别于第一次半数大鼠稀便时、第一次80%大鼠的稀便消失时、第二次半数大鼠稀便时、第二次80%大鼠的稀便消失时、第三次半数大鼠稀便时，随机选取实验组及对照组大鼠各4只，乙醚麻醉，经腹正中切口，迅速切取胃窦、空肠（距幽门15 cm）、回肠（距回盲瓣5 cm）、盲肠、横结肠、直肠（距肛缘2 cm）组织块约1 cm，生理盐水冲洗，多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片检测。泻剂结肠模型建成后，将所有剩余大鼠乙醚麻醉，股动脉取血3 ml，检测5HT，开腹切取距幽门5 cm的十二指肠、距肛缘5 cm乙状结肠组织块，重约200 mg，检测组织匀浆中5HT，同前顺序切取胃肠道6块组织，多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片检测。 　　　1.6.1 免疫组化染色观察肠嗜铬细胞变化 　　镜下观察免疫反应阳性细胞分布及形态，每张切片高倍镜（400×）下随机选取10个视野，进行免疫反应阳性细胞计数，统计平均值。 　　1.6.2 十二指肠、乙状结肠组织匀浆中5HT含量测定 　　十二指肠、乙状结肠组织块制成20%匀浆，双缩脲法测定组织匀浆中的总蛋白（TP）。计算总蛋白含量=测定×标准浓度/标准（g/L）。取组织匀浆200 μl，采用荧光分光光度法测定组织匀浆中5HT荧光强度，标准品浓度为300 μg/L，组织匀浆5HT含量=测定×标准浓度/（标准×组织TP含量）（μg/g）。 　　1.6.3 血清5HT含量测定 　　同上法，血清5HT含量=测定×标准浓度/标准（μg/L）。 　　1.7 统计分析 　　数据采用x±s表示，采用SPSS12.0统计软件进行成组t检验。 　　2 结 果 　　2.1 血清、组织