使用抗氧化剂调控胞内ROS对脐血CD34+细胞体外扩增特性影响.doc

使用抗氧化剂调控胞内ROS对脐血CD34+细胞体外扩增特性影响 　【摘要】 目的: 使用抗氧化剂调控胞内活性氧物质(ROS)水平, 考察其对脐血CD34+细胞体外扩增特性的影响。方法: 在体外培养过程中, 分别采用超氧化物歧化酶（SOD）、 过氧化氢酶（CAT）或N乙酰半胱氨酸（NAC）3种抗氧化剂降低脐血CD34+细胞内的ROS水平, 研究了CD34+细胞在抗氧化剂清除ROS后的体外扩增特性。结果: 体外培养时细胞因子的应用会使细胞内的ROS水平显著上升。3种抗氧化剂均能有效地清除细胞内ROS, 且清除程度随使用剂量的改变而变化。在培养体系中添加2 000 U/mL SOD、 200 U/mL CAT 或2 mmol/L NAC, 扩增后培养物中CD34+细胞及CD34+CD38-细胞的比例、 集落生成细胞的密度均有明显提高, 但对CD34+细胞扩增倍数影响不大; 而加入8 000 U/mL SOD、 1 000 U/mL CAT 或5 mmol/L NAC, 抑制CD34+细胞的扩增能力。结论: 采用细胞因子体外扩增脐血CD34+细胞时, 使用低剂量的抗氧化剂适度清除细胞内的ROS, 明显提高培养物中造血干/祖细胞的含量, 同时并不影响扩增后CD34+细胞的再扩增能力。 【关键词】 活性氧（ROS） CD34+造血干/祖细胞 体外扩增 抗氧化剂 　　造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSC)被广泛地应用于干细胞移植、 生物免疫治疗、 细胞治疗和基因治疗等领域, 但细胞数量不足是限制其应用的瓶颈。尽管造血干细胞体外扩增能有效地解决这一问题, 但不少研究发现体外扩增很可能会导致其细胞功能的损伤［1, 2］。所以如何在体外模拟造血环境, 以获得高活性的造血干/祖细胞是近年来该领域的研究热点。目前, 人们研究HSC体外培养仅仅局限于细胞因子组合、 溶氧、 基质共培养、 动态搅拌等外界培养条件的控制［3］, 但关于体外因素是通过何种途径影响细胞功能、 以及如何调控胞内活性物质以提高细胞活性的研究很少。 　　本研究室在比较分析了培养前后脐血CD34+细胞基因表达差异, 发现细胞的抗氧化酶基因表达有明显不同［4］, 提示体外培养对HSC胞内的氧化还原水平有重要影响。活性氧物质(reactive oxygen species, ROS)是细胞内氧代谢的副产物, 其在细胞内的一系列生理活动中作为信号分子发挥作用, 如调控细胞的增殖、 分化、 衰老及凋亡［5］。我们曾研究了氧压对CD34+细胞扩增的影响, 发现细胞内ROS的生成随氧压的降低而减少, 而降低CD34+细胞扩增过程中细胞内ROS水平有利于扩增后细胞功能的维持［6］。为此, 本研究进一步使用不同剂量及种类的抗氧化剂调控胞内ROS水平, 考察其对脐血CD34+细胞体外扩增特性的影响。期望通过适度地调控体外扩增过程中CD34+细胞的氧化还原水平, 获得更好的扩增效果。 　　1 材料和方法 　　1.1 脐血来源与脐血CD34+细胞的分离 脐血由上海国际和平妇婴保健院提供。脐血经淋巴细胞分离液梯度离心后, 收集单个核细胞, 并以IMDM培养基洗涤2次后备用。采用MiniMACS免疫磁性吸附柱分离装置进行CD34+细胞的纯化, 按照CD34+细胞选择试剂盒（Milienyi Biotech）说明书进行操作即获得纯化的CD34+细胞, 经过流式细胞术（FCM）分析, 分离后的CD34+细胞纯度在95%以上。 　　1.2 CD34+细胞的体外培养 体外培养基本培养基用IMDM（Gibco）, 添加200 mL/L胎牛血清, 采用的细胞因子组合为SCF+IL6+IL3, 其浓度分别为: 50、 20、 5 μg/L。超氧化物歧化酶SOD(浓度分别为2 000和8 000 U/mL); 过氧化氢酶CAT(浓度分别为200和1 000 U/mL); N－乙酰半胱氨酸NAC(浓度分别为2和5 mmol/L)与细胞因子一同加入到培养基中。细胞以1×109/L密度接种于24孔板, 每孔2 mL, 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中进行培养, 当培养至第4天时半量稀释换液（即取出一半的培养基和细胞, 补加相同体积的新鲜培养基、 细胞因子及相应的抗氧化剂)。在培养过程中, 以不加抗氧化剂进行常规培养为对照组, 加入2 000 U/mL SOD、 200 U/mL CAT或2 mmol/L NAC进行培养为低剂量组, 加入8 000 U/mL SOD、 1 000 U/mL CAT或5 mmol/L NAC为高剂量组。以培养7 d后进行细胞记数并检测培养物中CD34+细胞比例, 计算CD34+扩增倍数, 以评价CD34+细胞的扩增能力