可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白原核表达、鉴定及纯化及其对皮质神.docVIP

可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白原核表达、鉴定及纯化及其对皮质神 　 作者：周国钰， 胡学强， 胡 骏， 陆正齐， 楼之茵， 朱灿胜， 熊洁萍 【摘要】 【目的】 构建含蛋白转导域(protein transduction domain, PTD)与脑红蛋白(neuroglobin, Ngb)融合基因的表达质粒，原核表达可溶性TAT PTD-Ngb，并鉴定、纯化，检测TAT PTD-Ngb对皮质神经元的跨膜转导功能。【方法】 提取SD大鼠脑组织总RNA，通过RT-PCR法构建编码TAT PTD-Ngb的融合基因，克隆入pET28b原核表达载体，转化入大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，诱导表达，表达产物进行SDS、Western-blot分析及可溶性鉴定，利用所表达的目的蛋白上的6个组蛋白用Ni-NTA琼脂进行亲和层析纯化，将不同浓度纯化的融合蛋白与原代培养皮质神经元共孵育2 h，用Western-blot分析融合蛋白的跨膜转导。【结果】 成功构建了含有TAT PTD-Ngb的原核表达载体，插入片段500 bp，成功表达并纯化了可溶性TAT PTD-Ngb融合蛋白，相对分子质量约为20 k，Western blot鉴定显示表达蛋白具有抗原性，并具有转导入原代培养皮质神经元的功能，随给予蛋白浓度的增高进入神经元内的融合蛋白量增高。【结论】 可溶性融合蛋白TAT PTD-Ngb可转导入皮质神经元，对进一步研究Ngb的功能及蛋白转导技术的应用奠定了基础。 【关键词】 蛋白转导域； 脑红蛋白； 可溶性原核表达 合入扩增的Ngb 5′端，构建含有TAT PTD-Ngb融合基因的原核表达质粒，诱导表达、鉴定及纯化，用原代培养的原代皮质神经元对其跨膜转导功能进行检测，为下一步利用蛋白转导技术研究Ngb在神经系统内的功能奠定基础，提供新的方法。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒和菌株 　 T7 RNA聚合酶调控的表达质粒pET28b及表达T7 RNA聚合酶的大肠杆菌BL21（DE3）plysS购自Novagen公司；pMD19-T simple载体购自大连宝生物工程公司；大肠杆菌DH5α由本校药理学教研室胡骏博士赠送。 1.1.2 试剂 　 Trizol试剂购自Invitrogen公司；合成cDNA第一链的逆转录试剂盒购自Fermentas公司；Taq DNA聚合、T4 DNA连接酶和各种限制性内切酶购于大连宝生物工程公司；X-gal、IPTG购于AMRESCO公司；质粒抽提试剂盒、胶回收纯化试剂及Ni-NTA蛋白亲和纯化琼脂购于QIAGEN公司；抗His-Tag小鼠单克隆抗体购于TIAGEN公司，羊抗小鼠二抗购于武汉博士德生物技术有限公司；氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素均为SIGMA分装；ECL试剂购自PIERCE公司；Neurobasal培养基及B27购自Gibco公司。其余常规试剂均为进口或国产分析纯。 1.1.3 PCR引物　 根据Genbank中大鼠Ngb和TAT-PTD基因序列设计了两条引物，即在Ngb成熟肽基因序列的5′端融合了含有PTD基因序列，由上海生工生物技术有限公司合成。上游引物：5′CATATGAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGA GCTAGCATGGAGCGCCTAGAGTCAGAGCT 3′（含NdeⅠ、NheⅠ酶切位点）；下游引物：5′ GAGCTCTA CTCCCCGTCCCAGCCTCG 3′（含SacⅠ酶切位点）。扩增产物片段500 bp。 1.1.4 实验动物　 SD乳鼠由中山大学实验动物中心提供。 １.2　 TAT PTD-Ngb基因的克隆 1.2.1 RT-PCR扩增TATPTD-Ngb基因 取SD乳鼠脑组织用Trizol试剂提取脑组织总RNA，按逆转录试剂盒说明合成cDNA第一条链，取2 μＬ逆转录产物进行PCR，反应条件如下：94 ℃预变性5 min ，94 ℃ 30 s、68 ℃40 s、72 ℃ 1 min ，循环30次，72 ℃延伸10 min。PCR 产物进行0.15 g/L琼脂糖电泳分析，并对目标条带切胶回收。 1.2.2 PCR产物的克隆与测序　 PCR 产物经胶回收纯化后与pMD19-T simple载体用T4 DNA连接酶16 ℃连接2 h，转化DH5α感受态，涂布于含氨苄青霉素的LB 平板上，菌落经蓝白班筛选，抽提质粒经NdeⅠ / NheⅠ限制性内切酶双酶切鉴定，选取含目标片段的单克隆菌落并送上海英骏生物技术有限公司测序。 1.2.3 TAT PTD-Ngb表达质粒的构建 用NdeⅠ / NheⅠ限制性内切酶从阳性TA克隆载体上切下TAT PTD-Ngb基因序列并胶回收，与同样酶切的含His-tag的pET28b表达载