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单纯疱疹病毒I型糖蛋白B基因疫苗初步免疫学探究 　 作者：孟祥俊 苏云 贺冰 吴雅臻 【摘要】 目的 利用构建成功的重组真核表达质粒pgB免疫小鼠，探讨单纯疱疹病毒I型（HSVⅠ）gB基因作为基因疫苗的可能性。方法 用重组真核表达质粒pgB免疫小鼠，通过中和试验、ELISA方法检测pgB接种小鼠的免疫效果,并对免疫的小鼠进行病毒攻击。结果 实验小鼠产生了对HSV1特异性的抗体（抗体滴度：ELISA法1∶273，中和试验法：1∶49），实验组中和效价显著高于载体对照组和阴性对照组（P＜0.01）；对病毒的攻击并有免疫保护作用，实验组和空白对照组比较（P＜0.01）。结论 证明pgB真核表达质粒，具有DNA疫苗作用，可在小鼠体内诱发保护性免疫反应，pgB有可能作为基因疫苗用于单纯疱疹病毒性角膜炎预防和治疗，为进一步构建单纯疱疹病毒糖蛋白联合疫苗并最终用于单疱病毒角膜炎奠定了理论基础。 【关键词】 单纯疱疹病毒性角膜炎； 糖蛋白B ； 基因疫苗 单纯疱疹病毒性角膜炎（herpes simplex keratitis,HSK）主要是由单纯疱疹病毒I型（herpes simplex virus 1,HSV1）直接感染角膜上皮细胞引起的点状或树枝状角膜炎；在角膜基质内发生的免疫应答，引起盘状角膜炎、基质坏死性角膜炎〔1〕。HSV1可引起潜伏感染，在机体免疫力低下时，潜伏感染的HSV1可重新活化，引起HSK的复发，由于HSK的反复发作造成视力严重损害甚至失明。迄今对于HSV1的感染还未达到理想的治疗效果,故应寻求特异性强，效果更好的抗病毒药物或研制抗HSV1的安全疫苗来预防HSV1的感染和复发。本研究利用经鉴定构建成功的重组真核表达质粒pgB〔2〕作为疫苗免疫小鼠，证明了pgB基因疫苗可在动物体内表达目的蛋白，诱导机体产生特异性抗体，并具有免疫保护作用，为今后进一步研制HSVDNA联合疫苗用于单纯疱疹病毒角膜炎的预防和治疗奠定了基础。 1 材料与方法 1.1 材料 健康昆明种小鼠（购自吉林大学基础医学院动物实验室），雄性，体重（18±2）g，4～6周龄；大肠杆菌DH5α及真核表达质粒pcDNA3（吉林大学第一医院中心研究室提供）；重组真核表达质粒pgB由本研究的前期工作制备〔2〕。 1.2 方法 1.2.1 质粒的大量提取 转化有pcDNA3和pgB的大肠杆菌液严格按照无内毒素型质粒DNA大量纯化试剂盒（Vitagene）的说明书进行提取；将最终得到的质粒在紫外分光光度仪下测OD260/OD280和OD260。 1.2.2 质粒的内毒素检测 提纯的质粒pcDNA3和pgB定量分析后，鲎试剂检测有无凝集反应。 1.2.3 免疫小鼠〔3〕 本实验选取肌肉接种的方法，把昆明种小鼠随机分为实验组、载体对照组、空白对照组，每组10只。将小鼠双后肢用750 ml/L酒精消毒，双侧股四头肌多点注射。每组的PBS液与终浓度3%氢氧化铝胶悬液1∶1（V∶V）混合（简称混合液），直至全部乳化。实验组：注射含pgB的混合液，每侧200 μl（含pgB50 μg）；载体对照组：注射含pcDNA3的混合液，每侧200 μl（含pcDNA3 50 μg）；空白对照组：只注射混合液，每侧200 μl；间隔2 w，重复接种2次；末次免疫4 w后进行检测。取小鼠眼眶血，于37℃水浴中30 min后,1 000 r/min离心10 min，吸取血清，-20℃保存用于检测。 1.2.4 中和试验 参照文献〔3，4〕，将小鼠血清56℃ 30 min灭活后进行倍比稀释，取50 μl加入96孔细胞培养板，每个稀释度平行加6孔，加入100 TCID50的HSV1 SM44株病毒悬浮液（用细胞培养液稀释）50 μl/孔，密封培养板，置4℃过夜；加入1∶4的兔补体 50 μl/孔，置37℃1 h，每孔加50 μl(5×103个细胞)Vero细胞，放置37℃ CO2孵箱，培养5 d，以能中和50%的病毒活力作为标准，用ReedMuench法计算中和抗体滴度。 1.2.5 酶联免疫吸附实验（ELISA）〔5〕 为了建立有效的ELISA方法检测鼠抗pgB血清滴度，本研究以HSV1病毒包被酶标板，分别使用不同浓度的BSA、BSA 5组分、OVA和明胶作为封闭液进行ELISA检测，BSA、BSA 5组分和OVA的浓度为1%、1.5%、3%，明胶的浓度为0.3%、0.15%、0.075%。 加入倍比稀释的小鼠血清，用IgGHRP羊抗鼠IgG做为二抗，检测小鼠血清中特异性抗体，以P/N≥2.0为判断标准计算抗体滴度。 1.2.6 小鼠的免疫保护试验 参照文献〔5〕，小鼠免疫接种方法同前，将免疫接种后的各组小鼠腹腔注射0.5 ml含50 LD50的HSV1病