SSCP技术与胃癌.pptVIP

PCR－SSCP技术检测胃癌p53基因异常 何为PCR－SSCP技术？ 聚合酶链式反应-单链构象多态（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP） Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开.该方法为单链构象多态性 (Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析.在随后的研究中，又将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而建立了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性. P53基因与肿瘤 SSCP技术要求 PCR-SSCP检测基因突变优点： ①灵敏度高，0.1ug以下的微量模版DNA即可进行检测，并且与DNA长度、纯度无关。在癌组织中混有正常组织情况下，亦可根据异常区带的出现得以检出，不受正常组织干扰。微小的变异即使1个bp的变化或等位基因中的一个基因的变异也可检出。 ②快速、简捷，不使用限制性内切酶消化及DNA探针杂交等。检测大量标本室可用SSCP筛选异常基因，异常区带自凝胶中溶出后，经不对称PCR扩增产生单链直接测序，避免无选择的大量测序。PCR-SSCP是目前检测点突变最简捷的方法。 ③特异性高，选择不同的引物可对基因的不同片段进行检测，具有高度特异性和针对性。 * * 09生物科学 521宿舍 钟群 张媛燕 李思 吴福云 庄莉莉 ①PCR扩增靶DNA ③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ②将特异的PCR扩增产物变性（94℃高温下热变性10 min）， 而后快速复性（迅速冰浴10 min），使之成为具有一定空间结构 的单链DNA分子 ④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果.（若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变） 一般过程： SSCP的应用： ? 自从Orita等用SSCP进行人类DNA多态性分析以来，该方法大量地用于检测和肿瘤发生有关的基因突变，例如检测星形细胞瘤、脑瘤、小细胞肺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中的 p53基因的突变、肺癌的ras基因突变等. 胃癌高危 在日本，早期胃癌的检出率已达到60%~70%；在韩国，早期胃癌的检出率在50%左右；而在中国早期胃癌的检出率平均只有10%。90%中晚期胃癌的五年生存期不足20%；全球每年94万的胃癌新发病例其中有40万中国人；每年近30万国人死于胃癌，平均2~3分钟就有一位国人因胃癌死亡……因此 ,胃癌的防治十分重要。 人类P53基因位于17号染色体p13.1，其产物参与正常细胞周期的调节。大量研究表明，野生型p53基因为肿瘤抑制基因，而该基因的失活与人类肿瘤的发生密切相关。P53基因的主要失活途径是点突变和(或)等位基因缺失(allelie1055)。检测这些异常，对了解p53基因在肿瘤形成中的作用具有重要意义。 研究肿瘤组织中P53等位基因缺失的主要手段是分析该基因的杂合性缺失(Lossofheterozygosi-ty，LOH)，其前提是要分析基因的多态性(poly-morphism)，选择正常组织中P53基因呈杂合性的肿瘤病例，再将病人肿瘤组织与正常组织进行对比，若前者出现杂合性缺失，即表明在肿瘤组织中存在p53等位基因缺失。 1、将细胞迅速移入已准备好的20 μl消化液中，37℃过夜；PCR前煮沸5～10分钟，灭活蛋白酶K，冷却后6 000～10 000 r/min离心，取5 μl上清液DNA进行PCR扩增。 利用PCR-SSCP技术检测胃癌： 2、聚合酶链反应（PCR）：①引物序列如下： 第5外显子(E5):5’-TACTCCCCTGCCCTCAACAA-3’,5’-CATCGCTATCTGAGCA GCGC-3’。 第6外显子(E6): 5’-GTCTGGCCCCTCCTCAGCAT-3’，5‘-CTCAGGCGGCTCATAGGGCA-3’。 第7外显子（E7）: 5’-TCTGACTGTACCACCATCCA-3’，5’-C TGGAGTCTTCCAGTGTGAT-3’。 第8外显子(E8): 5’-TGGTAATCTACTGGGACGGA-3’， 5’-CGGAGATTCTCTTCCTCTGT-3‘。 第4～9外显子(E4～9): 5＇-GGAGGTGC