干扰素的制备 孙甸甸.ppt

4.1.1菌体裂解 裂解缓冲液：纯化水配制，2℃～10（pH7.5） 使用保护剂：EDTA，PMSF。 破碎菌体：2厘米以下的碎块 搅拌：加裂解缓冲液，2℃～10℃，2hr 冻融: 细胞完全破裂，释放干扰素。 4.1.2 预处理-沉淀 加絮凝剂聚乙烯亚胺: 2℃～10℃，搅拌45min，对菌体碎片进行絮凝。 加凝聚剂醋酸钙溶液: 2℃～10℃,搅拌15min，对菌体碎片、DNA等进行沉淀。 离心 连续流离心机：2℃～10℃，16000 r/min 收集上清液：含有重组干扰素蛋白质 杂质沉淀：121℃、30min 蒸汽灭菌,焚烧处理。 4.1.3初级分离 盐析: 硫酸铵，2℃～10℃，搅匀,静置过夜。 离心：连续流离心机，16000 r/min 保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃保存。 4.2干扰素纯化工艺过程 ★ 溶解粗干扰素 ★ 沉淀与疏水层析 ★ 阴离子交换层析与浓缩 ★ 阳离子交换层析与浓缩 ★ 凝胶过滤层析 ★ 无菌过滤分装 4.2.1溶解粗干扰素 配制纯化缓冲液： 超纯水，pH7.5磷酸缓冲液，0.45 μm滤器和10 ku超滤系统，百级层流下收集。冷却至2℃～10℃。 检查: 缓冲液的pH值和电导值。 溶解：2℃～10℃，匀浆，完全溶解。 4.2.2沉淀与疏水层析 等电点沉淀（1）：磷酸调节至pH5.0，沉淀杂蛋白，离心收集上清液。 疏水层析：干扰素吸附在疏水层析柱中 除非疏水性蛋白 洗脱与收集：0.01M磷酸缓冲液（pH8.0） 等电点沉淀（2）：磷酸调节pH4.5，调节电导值40 ms/cm，2℃～10℃，静置过夜 超滤：1000 ku超滤膜过滤，除去大蛋白。 透析除盐：调整溶液pH 8.0，电导值，10 ku超滤膜，0.005 M缓冲液。 4.2.3无菌过滤分装 ★0.22 μm滤膜过滤干扰素溶液 ★分装 ★－20℃以下的冰箱中保存。 * * * * * * * * * * 基因工程药物—α干扰素的生产工艺 孙甸甸 目录 CONTENTS 干扰素概述 1 基因工程菌的构建与保藏 2 干扰素的发酵工艺过程 3 干扰素的分离纯化工艺过程 4 1.1.1什么是干扰素？ 概念(interferon,IFN)：机体免疫细胞产生的一类细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。 根据分子结构和抗原性的差异：分为α、β、γ、ω等4个类型。 1.1.2天然干扰素的分类 1. 根据来源、基因序列和氨基酸组成分类  I 型干扰素： IFNα、IFNβ、IFN τ、IFN ω II 型干扰素：干扰素γ（IFN?) 来源：白细胞、成纤维细胞、病毒感染的组织细胞等 功能 ：抗病毒感染、抗肿瘤生长 免疫调节(较弱）其中IFN-α为多基因产物，有23种以上的亚型 来源：活化的T细胞和NK细胞产生 功能：免疫调节 提高单核巨噬细胞、树突状细胞的抗原提呈能力 增强Tc细胞和NK细胞的杀伤活性 抑制TH2细胞形成，下调体液免疫应答 趋化作用 抗病毒和抗肿瘤作用（次要） 2. 根据动物来源确定分类，例如人干扰素（HuIFN），小鼠干扰素（MuIFN）。 143-166AA； MW:18-40 ku； pI: 6.5-7.5； 乙醚、氯仿敏感 容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纤维膜、琼脂和塑料等介质。 1.2干扰素的理化性质 1.3干扰素的生物学活性 正常情况下组织或血清中不含干扰素，只有在某些特定因素的作用下才能诱使细胞产生干扰素。 1.3.1广谱抗病毒活性机制 Ⅰ型干扰素具有广谱的抗病毒活性，对多种病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但这种效应不是直接的，而是通过对宿主细胞的作用引起的。 1.4 重组干扰素的临床应用 广谱抗病毒活性（rhuIFNα） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。 直接抗肿瘤活性（rhuIFNα） 毛细胞和慢性髓样白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。 免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ） 多发性硬化症 rhuIFNβ 2.干扰素生产工艺路线 2.1、工程菌的构建 诱生的白细胞或成纤维细胞 提取总RNA 5%~23%蔗糖密度梯度离心提取12 S mRNA 12S mRNA 反转录成cD