第五章 工业微生物育种诱变剂.jsp.ppt

烷化鸟嘌呤的碱基配对 烷化剂除了以上诱变作用之外，还有可能使两个鸟嘌呤N7位点形成共价键，一般双功能烷化剂容易引起DNA双链间的交联，造成变异或死亡。 鸟嘌呤通过N7位点的共价结合而发生交联 * 烷化剂作用： 通过对鸟嘌呤N7位点的烷化而导致突变有三种可能： 烷化嘌呤引起碱基配对错误， 脱嘌呤作用， 鸟嘌呤的交联作用 总结鸟嘌呤N7位点的烷化作用 烷化剂的性质 ——烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生水解。 ——它们大部分半衰期很短，其长度与温度、溶液pH关系很大。因此，化学诱变剂要现用现配。 ——不少烷化剂见光后，容易发生光化学反应，和水解作用一样，有的分解产物会失去诱变作用或具毒性。因此，保藏时要注意避光，置棕色瓶中，放在干燥器或冰箱中保存。 ——另外，配制烷化剂溶液时，要采用合适的pH缓冲液。 烷化剂名称 理化特性 pH7水中半衰期/h 分子量 状态 水溶性 溶点或沸点 20℃ 30℃ 37℃ 甲基磺酸乙酯(EMS) 无色液体 约8% 沸点85~86℃/10mmHg 93 26 10.4 124 乙烯亚胺(EI) 无色液体 易溶于水 沸点56℃/760mmHg 43 亚硝基乙基脲(NEU) 粉红色液 约5% 沸点53℃/5mmHg 84 117 亚硝基甲基脲(NMU) 黄色固体 35 103 硫酸二乙酯(DES) 无色油状物 不易溶 3.34 1 0.5 亚硝基胍(NTG) 黄色固体 熔点118℃ 烷化剂的某些性质 几种常用的烷化剂： 1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（简称亚硝基胍，NTG或NG或MNNG） 为黄色结晶状物质，性质不稳定，遇光易分解，放出NO，颜色由黄色变为绿色，诱变效应降低。须保存在棕色瓶中，并在避光、干燥、低温条件下贮存。 NTG不溶于水，须加助溶剂，使用时现配现用。 NTG有超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效果好，尤其适合于诱发营养缺陷型突变株。其中处理细菌、放线菌等微生物时，不经淘汰，就可以直接得到10%以上的营养缺陷型突变株。而用一般诱变剂处理只能达百分之几至千分之几。 NTG的水溶液中随着不同的pH将产生不同的分解产物，从而影响诱变效应。 当溶液pH低于5.5时，NTG分解成HNO2, HNO2本身就具诱变作用； 当溶液pH在8.0以上时，NTG会分解产生重氮甲烷（CH2N2），对核酸起烷化作用，引起微生物突变； 当溶液pH为6.0时，NTG本身和DNA起烷化反应而导致突变。 通常在pH6.0的条件下进行诱变处理。由于酸碱条件影响NTG的诱变效果，因此，无论是配制NTG溶液，还是制备均悬液都要用适宜的缓冲溶液。常用的由磷酸缓冲液和Tris缓冲液. 1.取新鲜的斜面，用一定pH值的缓冲液或Tris缓冲液洗下细菌制成菌悬液。如果采用细菌细胞或丝状菌孢子（真菌或放线菌）须进行前培养，可用有关培养基代替以上缓冲液，孢子培养时间控制在大部分孢子处在萌动阶段，经离心、洗涤，用缓冲液制成悬液，浓度约在106-107ml-1； NTG的诱变处理方法： 2.配制NTG母液： 由于NTG不溶于水，配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮少许，然后加缓冲溶液，其比例为9：1（缓冲溶液9ml：NTG丙酮溶液1ml），一般NTG母液浓度配成1mg/ml。使用时取母液0.2ml，加菌悬液1.8ml，NTG最后处理浓度为100μg/ml。一般处理浓度随菌种不同而异，通常细菌为100—1000μg/ml，而放线菌、真菌孢子为1000—3000 μg/ml 。 3.将以上菌悬液和NTG溶液混合于一试管内，置该菌生长适宜的温度下保温处理若干时间。 4.终止反应。用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温下进行离心洗涤，除去药液，加无菌水使沉淀悬浮并作成一定稀释度分离于平皿。 处理完毕后，马上把接触过NTG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸泡处理。 除以上直接以溶液处理外，也可以进行如下方法诱变处理： 1.摇瓶振荡处理 2.在平皿上生长过程处理 NTG是一种强烈的致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，例如用自来水大量冲洗或用1—2mol/L的NaOH或2%的Na2S2O3浸泡过夜，洗净。 * 甲基磺酸乙脂（EMS） 使G的第6位烷化，使T的第4位上烷化，结果产生的O-6-E-G和 O-4-E-T分别和T、G配对，导致G∶C对转换成A∶T对；T∶A对转换成C∶G * 三、移码诱变剂 是一类能够嵌入到DNA分子中的物质 吖啶类染料（acridine dye）、溴化乙锭（ethidium bromide）和一系列ICR类化合物 溴化乙锭（EtBr） 由美国的